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DNA甲基化作为表观遗传学的一种,在维持胚胎发育、基因印记、正常细胞功能以及人类疾病发生中起着重要作用。检测DNA甲基化对疾病特别是肿瘤进行早期诊断、预后分析、合理用药等有重要的临床意义。因此快速准确、操作简便、成本低廉的分析技术是甲基化研究及临床检测所必需的。本文综合比较了不同的DNA甲基化检测技术的优缺点后以及在临床检测的可行性,提出了改良多重实时荧光定量PCR技术(quantitative methylation specificPCR with Homo-Tag Assisted Non-Dimer system,HANDs-qMSP),并利用该技术检测64份大肠癌标本及其正常对照的CpG岛甲基化表型(CpG island methylatorphenotype,CIMP),包括RUNX3、APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50,利用HANDs-qMSP技术对64份大肠癌组织及64份与之对应正常对照进行临床评估,结果显示,CIMP中至少有一个基因发生甲基化的概率为85.94%(55/64),其中RUNX3、APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50的甲基化阳性率分别为7.81%(5/64)、15.63%(10/64)、29.69%(19/64)、65.63%(42/64)、54.69%(35/64),特异性分别为100.00%(64/64)、98.44%(63/64)、96.88%(62/64)、90.62%(58/64)、83.74%(54/64)。与普通多重实时荧光定量PCR方法和传统的基于MethyLight发展起来的技术相比,HANDs-qMSP技术具有以下几个优点:(1) HANDs-qMSP技术设置了一份98%质控管,该质控管不仅可以作为100%阳性对照,还可作为亚硫酸盐转化效率为98%的指标,用于指示标本亚硫酸盐转化效率的高低,从而有效避免由亚硫酸盐转化效率太低所导致的假阴性结果。(2) HANDs-qMSP技术采用了同源加尾(Homo-Tag Assisted Non-Dimersystem,HAND)系统,HAND系统能有效地抑制引物二聚体的产生,减小多重PCR体系中各基因间扩增效率的差异,提高相对定量的精确度。本论文所建立的HANDs-qMSP体系最低可检测到10pg/反应,且能精确定量至0.01%。同时HANDs-qMSP是多重PCR体系,在同一反应管中可同时检测分析多个基因,不仅节约了试剂和标本用量,而且使操作更加简便,减少劳动量。