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口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)引起的一种急性热性高度接触性传染病,对猪牛羊等家畜和许多野生动物危害严重。灭活疫苗对口蹄疫的防控起了巨大作用,但其弊端也不容忽视。近些年来,新型口蹄疫疫苗一直是人们研究的方向之一。转基因植物疫苗由于其成本低廉,安全有效,使用方便等优点成为科学家研究的热点。 本研究利用农杆菌侵染法将FMDV Asial/YNBS/58株P12A-3C基因导入牧草百脉根。通过构建转基因植物表达载体,农杆菌侵染百脉根外植体及组织培养,抗性植株的检测筛选,转基因百脉根植株茎叶浸出物免疫豚鼠的研究,探索目的基因在牧草百脉根的转化、表达及免疫活性。主要进行如下工作: 1.目的基因的获得:Asial/YNBS/58乳鼠毒,连传2代乳鼠复壮,提取病毒总RNA,通过RT-PCR获得目的基因P12A和3C,将目的基因连接克隆载体,测序分析。结果表明,P12A全长2247nt,编码749个氨基酸,结构蛋白P1编码733个氨基酸,2A编码16个氨基酸,其中VP4编码85个氨基酸,VP2编码218个氨基酸,VP3编码219个氨基酸,VP1编码211个氨基酸,通过分析表明FMDV各个结构蛋白及非结构蛋白切割位点比较保守,各结构蛋白之间联接氨基酸分别为A/D,E/G,Q/T,2A的C末端具有保守的DxExNPG多肽序列。细胞受体结合位点为VP1上的RGD序列。3C全长639nt,编码213个氨基酸。 2.植物双元表达载体的构建:通过设计的引物扩增带有特定酶切位点的目的基因,通过酶切、连接将口蹄疫病毒P12A基因、3C基因串联,构建植物中间表达载体pBin438-P12A-3C。试验先将基因片段P12A-3C连接到pcDNA3.1(+)质粒,构成pcDNA3.1(+)-P12A-3C,然后再将P12A-3C片段从该质粒上切下来,连接到pBin438载体上。通过对构建好的pBin438-P12A-3C(Mini-Tj)重组质粒进行PCR鉴定和序列测定,证明中间表达载体构建成功。通过三亲杂交法将重组质粒pBin438-P12A-3C导入农杆菌GV3101,通过抗性筛选、农杆菌提取质粒PCR鉴定和序列测定,证明构建成功,与农杆菌中的help-Ti质粒共同组成植物双元表达载体系统,为下一步的转化奠定基础。 3.目的基因转化百脉根与蛋白表达检测:以百脉根子叶、子叶柄为转化受体,通过根癌农杆菌GV3101侵染外植体子叶或子叶柄,经过愈伤、出芽和生根等过程在含有50mg/L卡那霉素的培养基筛选后,获得抗性植株。对抗性植株进行PCR、RT-PCR和ELISA检测筛选阳性植株,为下一步动物免疫试验提供候选植物材料。 4.转基因百脉根免疫豚鼠:将上述检测阳性的植株蛋白提取液,非转基因植株蛋白提取液,同时设转基因空载体对照,Asial灭活苗阳性对照和弗氏佐剂对照分别免疫豚鼠。首次免疫后第14d、28d采血,二免后分别于第7d、14d和21d采血,ELISA检测表明产生特异性抗体。血清效价最高1:64。