抗坏血酸（Ascorbic acid,As A）,又名维生素C（Vitamin C,Vc）,是生物体内重要的抗氧化剂和许多酶的辅助因子。水果是人类主要的天然As A来源,其As A含量主要取决于果实细胞中从头生物合成能力。与猕猴桃等果实相比,苹果果实低As A的原因主要与其合成能力弱有关,挖掘其低合成的调控机制,是苹果As A改良的基础。课题组前期研究发现,苹果中AMR1（ascorbic acid mannose pathway regulator 1）同源基因的表达与果实As A含量负相关,本论文进一步分析了苹果中AMR1同源基因的表达与As A的关系,获得了Md AMRL1.1和Md AMRL1.2转基因苹果株系,分析了转基因株系中As A含量的变化及其机制,主要结果如下:1.对‘绿绣’苹果转录组和蛋白质组学数据中As A合成代谢相关基因分析结果表明,在苹果基因组中有7个AMR1同源基因,其中与叶片等高As A含量的组织相比,Md AMRL1.1和Md AMRL1.2在低As A含量的果实中高度表达,其中在果实发育过程中Md AMRL1.1 m RNA表达与As A含量呈负相关,且其受光的抑制,这暗示着苹果果实中低As A含量可能与Md AMRL1.1高度表达有关。进一步从‘嘎拉’苹果中克隆到了Md AMRL1.1、Md AMRL1.2基因全长序列,其中Md AMRL1.1包括一个1275bp的ORF（开放阅读框）,编码284个氨基酸;Md AMRL1.2包括一个1254bp的ORF,编码277个氨基酸,二者均含有F-box结构域。同时,Md AMR1.1/1.2均不存在跨膜结构域,对其亚细胞定位研究表明,Md AMRL1.1/1.2定位于细胞质和细胞核。2.构建了病毒诱导的基因沉默（VIGS）载体p TRV2-Md AMRL1,在‘红星’苹果果实（花后75天）中进行了VIGS实验,结果表明,相比于对照组p TRV2,注射p TRV2-Md AMRL1的果肉中Md AMRL1.1/1.2 m RNA和蛋白质的表达均显著下降,As A含量显著增加,As A含量的Ag NO3染色也证实注射区域As A含量明显增加。3.为了进一步验证Md AMRL1.1/1.2在调控As A含量中的功能,我们进行了苹果稳定遗传转化试验,获得了Md AMRL1.1/1.2转基因苹果过量和沉默株系。在过表达植株中,Md AMRL1.1 m RNA及蛋白水平表达量均上升,叶片中的抗坏血酸含量显著下降,但对糖及光合作用无明显影响;而过量表达Md AMRL1.2对As A含量无明显影响。同时在干扰株系中,研究发现干扰株系叶片中的Md AMRL1 m RNA及蛋白水平表达量均下降,抗坏血酸含量稍有增加。利用q RT-PCR对转基因株系As A合成和代谢相关基因表达的分析发现,Md AMRL1.1过表达对As A合成基因的表达并没有明显的抑制作用,反而GMP1等重要合成酶基因的表达有所增加。4.为探索过表达Md AMRL1.1对苹果叶片As A含量影响的分子机制,对其中3个过表达苹果株系进行了转录组分析,发现Md AMRL1.1的过量表达引起了转基因苹果中154个基因上调,85个基因表达下调,但参与As A合成代谢及调控的相关基因大部分表达无明显变化,而As A合成关键基因GMP1、GME1、MIXO及As A调控相关转录因子ERF98表达量显著上调。在VIGS诱导Md AMRL1沉默的苹果果实中,GMP1蛋白的表达明显增加,而Md AMRL1.1过表达的转基因苹果中GMP1蛋白表达明显下调。利用双分子荧光杂交对AMRL1.1和GMP1蛋白的互作关系研究表明,AMRL1.1能与GMP1互作,且泛素化抑制剂MG132处理能明显增强双分子荧光杂交信号,这些结果表明AMRL1.1能与GMP1互作,可通过泛素化调控GMP1蛋白的水平,进而负调控苹果中As A的合成。同时,Md AMRL1.1过表达转基因苹果中As A合成基因GMP1等表达的上调可能是As A合成的一种反馈调控机制。