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研究背景及目的：
多发性硬化（MultipleSclerosis,MS）是免疫介导的中枢神经系统慢性炎性脱髓鞘性疾病。既往研究认为，多发性硬化的发生发展是由外周自身反应性T细胞的激活并进入中枢神经系统进而募集幼稚的小胶质细胞所导致的。但人们越来越意识到单独用T细胞介导的炎症机制无法解释与炎症相关的神经退行性病变。Yap是Hippo途径的下游有效分子，既往研究已经表明其基因位点与多种类型的癌症相关。然而新的研究进展表明，Yap在免疫相关的疾病中也发挥重要作用。研究表明，在中枢神经系统中，Yap主要在星形胶质细胞中表达。星形胶质细胞作为中枢神经系统（centralnervoussystem,CNS）的一种特殊类型的免疫神经胶质细胞,在压力或病理性损伤下可被激活,并释放多种促炎细胞因子，趋化因子和中性粒细胞，以引起组织损伤。最近，研究人员发现Yap缺失可导致反应性星形胶质细胞增生和星形胶质细胞驱动的小胶质细胞激活。此外，星形胶质细胞中的Yap对于预防炎症途径中JAK/STAT的过度活化是必需的。总的来说，Yap对抑制炎症反应和维持星形胶质细胞处于静止状态至关重要。因此，本文旨在探索Yap与实验性自身免疫性脑脊髓炎(ExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis,EAE)模型疾病的发生发展的相关性。
研究方法：
1.普通EAE模型的建立及神经功能评分
选取健康、8-10周龄、雌性C57BL/6小鼠，所有小鼠均采用皮下多点注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MyelinOligodendrocyteGlycoprotein，MOG）与完全弗氏佐剂（CompleteFreundsAdjuvant,CFA）的乳化剂以及腹腔注射百日咳毒素（PertussisToxin,PTX）的方法诱导模型的建立。将小鼠随机分为EAE造模组和佐剂对照组，每组分别为8只。每天观察小鼠一般情况，监测体重变化及神经功能评分。
2.培育YapGFAP-条件性基因敲除小鼠，构建EAE模型
取性成熟（雌鼠35-50日龄，雄鼠45-60日龄）GFAP-Cre+雄性小鼠与Yapf/f雌性小鼠杂交（交配比例为雌性：雄性=2∶1）来产生GFAP-Cre+/Yapf/w小鼠。然后用Yapf/f雌性小鼠繁殖GFAP-Cre+/Yapf/w雄性小鼠。该育种策略产生25%纯合小鼠（YapGFAP-条件性基因敲除）小鼠。然后选取健康、8-10周龄、雌性YapGFAP-条件性基因敲除小鼠和野生型的小鼠各5只，构建EAE动物模型。每天观察小鼠一般情况，监测体重变化及神经功能评分。
3.病理学分析及实验室检测
1)在发病高峰期处死小鼠。分离EAE造模组和佐剂对照组的脊髓（颈段，胸段，腰骶段）和小脑，通过westernblot技术检测不同组别不同组织中Yap蛋白的表达水平。行H&E染色及LuxolFastBlue染色观察不同组别不同脊髓节段白质的炎症和脱髓鞘等病理变化；尼氏染色技术观察组间神经元数量形态变化。行免疫荧光技术对Yap蛋白进行定位定量分析，评估星形胶质细胞的数量及活化状态。
2)取发病高峰期YapGFAP-条件性基因敲除小鼠和普通EAE造模组小鼠的脊髓（颈段，胸段，腰骶段），并对各个节段的脊髓进行组织学评估，包括H&E染色，LuxolFastBlue染色，尼氏染色，免疫荧光。
研究结果：
1.小鼠的体重监测和神经功能评分：普通EAE小鼠多在免疫后第14-16天发病，伴有体重下降。YAP基因敲除EAE组多在免疫11-14天发病，伴体重下降。
2.Westernblot检测：普通EAE造模组颈段脊髓，胸段脊髓，腰骶段脊髓，YAP蛋白表达均高于佐剂对照组，P-Yap表达低于佐剂对照组。
3.H&E及LuxolFastBlue染色：H&E染色可见YapGFAP-条件性基因敲除EAE造模组、普通EAE造模组脊髓实质内大量炎症细胞浸润，YapGFAP-条件性基因敲除小鼠炎症细胞浸润程度明显高于普通EAE造模组。髓鞘LuxolFastBlue染色示YapGFAP-条件性基因敲除EAE造模组和普通EAE造模组白质内有散在大小不等的片状缺失。病理学分析提示普通EAE造模组髓鞘脱失的程度明显低于YapGFAP-条件性基因敲除的EAE造模组。
4.免疫荧光和尼氏染色：与佐剂对照组相比，EAE造模神经元减少。Yap在EAE造模组的脊髓中表达上升，星形胶质细胞激活，数量增加，形态发生改变。与普通EAE造模组相比，YapGFAP-条件性基因敲除EAE小鼠脊髓神经元减少较明显。免疫荧光发现，YapGFAP-条件性基因敲除EAE小鼠较普通EAE造模组Yap表达下降，星形胶质细胞增殖减少，活化增多。
结论：
1.Yap可能在EAE模型的疾病过程中起保护作用。
2.Yap在EAE模型中的作用可能与星形胶质细胞的数量和活化状态有关。
多发性硬化（MultipleSclerosis,MS）是免疫介导的中枢神经系统慢性炎性脱髓鞘性疾病。既往研究认为，多发性硬化的发生发展是由外周自身反应性T细胞的激活并进入中枢神经系统进而募集幼稚的小胶质细胞所导致的。但人们越来越意识到单独用T细胞介导的炎症机制无法解释与炎症相关的神经退行性病变。Yap是Hippo途径的下游有效分子，既往研究已经表明其基因位点与多种类型的癌症相关。然而新的研究进展表明，Yap在免疫相关的疾病中也发挥重要作用。研究表明，在中枢神经系统中，Yap主要在星形胶质细胞中表达。星形胶质细胞作为中枢神经系统（centralnervoussystem,CNS）的一种特殊类型的免疫神经胶质细胞,在压力或病理性损伤下可被激活,并释放多种促炎细胞因子，趋化因子和中性粒细胞，以引起组织损伤。最近，研究人员发现Yap缺失可导致反应性星形胶质细胞增生和星形胶质细胞驱动的小胶质细胞激活。此外，星形胶质细胞中的Yap对于预防炎症途径中JAK/STAT的过度活化是必需的。总的来说，Yap对抑制炎症反应和维持星形胶质细胞处于静止状态至关重要。因此，本文旨在探索Yap与实验性自身免疫性脑脊髓炎(ExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis,EAE)模型疾病的发生发展的相关性。
研究方法：
1.普通EAE模型的建立及神经功能评分
选取健康、8-10周龄、雌性C57BL/6小鼠，所有小鼠均采用皮下多点注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MyelinOligodendrocyteGlycoprotein，MOG）与完全弗氏佐剂（CompleteFreundsAdjuvant,CFA）的乳化剂以及腹腔注射百日咳毒素（PertussisToxin,PTX）的方法诱导模型的建立。将小鼠随机分为EAE造模组和佐剂对照组，每组分别为8只。每天观察小鼠一般情况，监测体重变化及神经功能评分。
2.培育YapGFAP-条件性基因敲除小鼠，构建EAE模型
取性成熟（雌鼠35-50日龄，雄鼠45-60日龄）GFAP-Cre+雄性小鼠与Yapf/f雌性小鼠杂交（交配比例为雌性：雄性=2∶1）来产生GFAP-Cre+/Yapf/w小鼠。然后用Yapf/f雌性小鼠繁殖GFAP-Cre+/Yapf/w雄性小鼠。该育种策略产生25%纯合小鼠（YapGFAP-条件性基因敲除）小鼠。然后选取健康、8-10周龄、雌性YapGFAP-条件性基因敲除小鼠和野生型的小鼠各5只，构建EAE动物模型。每天观察小鼠一般情况，监测体重变化及神经功能评分。
3.病理学分析及实验室检测
1)在发病高峰期处死小鼠。分离EAE造模组和佐剂对照组的脊髓（颈段，胸段，腰骶段）和小脑，通过westernblot技术检测不同组别不同组织中Yap蛋白的表达水平。行H&E染色及LuxolFastBlue染色观察不同组别不同脊髓节段白质的炎症和脱髓鞘等病理变化；尼氏染色技术观察组间神经元数量形态变化。行免疫荧光技术对Yap蛋白进行定位定量分析，评估星形胶质细胞的数量及活化状态。
2)取发病高峰期YapGFAP-条件性基因敲除小鼠和普通EAE造模组小鼠的脊髓（颈段，胸段，腰骶段），并对各个节段的脊髓进行组织学评估，包括H&E染色，LuxolFastBlue染色，尼氏染色，免疫荧光。
研究结果：
1.小鼠的体重监测和神经功能评分：普通EAE小鼠多在免疫后第14-16天发病，伴有体重下降。YAP基因敲除EAE组多在免疫11-14天发病，伴体重下降。
2.Westernblot检测：普通EAE造模组颈段脊髓，胸段脊髓，腰骶段脊髓，YAP蛋白表达均高于佐剂对照组，P-Yap表达低于佐剂对照组。
3.H&E及LuxolFastBlue染色：H&E染色可见YapGFAP-条件性基因敲除EAE造模组、普通EAE造模组脊髓实质内大量炎症细胞浸润，YapGFAP-条件性基因敲除小鼠炎症细胞浸润程度明显高于普通EAE造模组。髓鞘LuxolFastBlue染色示YapGFAP-条件性基因敲除EAE造模组和普通EAE造模组白质内有散在大小不等的片状缺失。病理学分析提示普通EAE造模组髓鞘脱失的程度明显低于YapGFAP-条件性基因敲除的EAE造模组。
4.免疫荧光和尼氏染色：与佐剂对照组相比，EAE造模神经元减少。Yap在EAE造模组的脊髓中表达上升，星形胶质细胞激活，数量增加，形态发生改变。与普通EAE造模组相比，YapGFAP-条件性基因敲除EAE小鼠脊髓神经元减少较明显。免疫荧光发现，YapGFAP-条件性基因敲除EAE小鼠较普通EAE造模组Yap表达下降，星形胶质细胞增殖减少，活化增多。
结论：
1.Yap可能在EAE模型的疾病过程中起保护作用。
2.Yap在EAE模型中的作用可能与星形胶质细胞的数量和活化状态有关。