研究背景纯钛因其良好的物理和机械特性以及高度的生物相容性被广泛应用于口腔种植领域。种植牙因为美观、舒适,并能很好的恢复咀嚼功能,作为人类的第三副牙齿,近年来被广泛接受。随着社会老龄化的发展,种植牙将面临更大的挑战。自1969年瑞典骨科学家Branemark提出“骨整合”(Osseo integration)以来,大量的学者对种植体的表面改性展开深入研究。微弧氧化(MAO)即放电阳极氧化,或称微等离子体氧化(MPO),是一种在金属表面沉积陶瓷涂层的新型阳极氧化技术。上世纪90年代末期利用微弧氧化技术对纯钛进行表面处理成为热点。近年来,微弧氧化技术应用于种植体表面处理已被证实具有很好的生物相容性和骨传导性,利于成骨细胞的粘附生长,与机械抛光纯钛相比具有更好的骨整合能力。据文献报道,目前的种植体在形成早期骨整合后与周围骨结合面积只有(45±16)%,最多50%-75%,经MAO处理后早期种植体的骨-种植体接触(BIC)也只有(49±12)%,远远低于100%。因此微弧氧化处理的种植体表面活性有待进步提高,使其更有利于早期种植体周围新骨的形成,从而提高种植体成功率。早在1972年,Fujishima报道了在光电池中受辐射的二氧化钛(Ti02)可产生光催化作用。光催化作用可以使Ti02氧化膜可以产生超亲水性的表面,这一现象在1997年被Wang等证实。这种超亲水性的产生是由于改变了钛表面亲水相的结构,目前具体机制有二：一是紫外线照射后通过在表面桥接位点产生氧空穴改变TiO2表面分子结构,使得Ti4+位点转化为Ti3+位点,此位点容易吸附空气中解离的水形成化学吸附水(含有大量活性羟基)；二是通过Ti02的光催化作用降解表面的碳氢化合物等污染,从而使表面润湿性增强。材料表面的亲水性是表面能具有代表性的标志,目前大部分学者认为增加材料表面亲水性会增加其表面能,并在一定程度上具有增加蛋白质吸附的能力,从而有利于细胞与材料的的进一步反应。TiO2光催化机理普遍认为：Ti02是一种半导体材料,它的禁带宽度为3.2ev,当TiO2受到大于3.2ev能量的光照射时会产生光催化作用,根据λ8(nm)=1240/E8(ec)得出小于387.5nm波长的光即可产生这一作用,而小于此波长的光为紫外光的波长范围,因此360nm波长的UVA和250nm波长的UVC紫外光都处于这个范围。目前已有报道使用UVC波段紫外线处理酸蚀纯钛表面后产生了超亲水性,促进了成骨细胞在酸蚀纯钛表面的粘附、增殖与分化,动物实验中第四周BIC即由51.7%提高至98.2%,而使用UVA波段紫外线作为表面处理的研究甚少。然而目前尚无同时用UVA和UVC两种不同波段紫外线分别处理微弧氧化纯钛表面的研究。根据λ(nm)=1240/E(ev),我们可知波长越短,产生的能量越大,因此,推测是否UVC波段紫外线比UVA波段紫外线处理微弧氧化膜会产生更强的光催化作用及生物活性作用。本实验旨在通过利用UVA和UVC两种不同波段紫外线分别对微弧氧化纯钛表面进行照射处理,探索不同波段紫外线处理微弧氧化纯钛后的光催化作用效果、表面理化性质的变化以及在早期细胞学性能上的影响,以期探索一种新型有效的种植体表面处理方法。目的探索UVA和UVC两种不同波段紫外线分别激发微弧氧化纯钛表面光催化作用对成骨细胞(MG-63)早期生物学行为的影响。方法1.商业四级纯钛切割成直径15mm钛片,SiC砂纸250目、400目、600目、1000目逐级打磨抛光,无水丙酮、无水乙醇、去离子水依次超声清洗。以甘油磷酸钠和乙酸钙配成电解液,低温下行微弧氧化处理。处理参数如下：电压350V,频率800HZ,占空比20%,氧化时间30s,去离子水超声清洗γ射线消毒后备用。无菌环境下使用15W UVC灭菌灯和15W UVA汞灯,距离材料表面10cm,对微弧氧化纯钛表面照射24h。未接受紫外线照射的为MAO对照组,UVA照射的为MAO+UVA实验组,UVC照射的为MAO+UVC实验组。用OCA表面接触角分析仪测量1μl水在材料表面的静态接触角大小；用带能谱分析系统的扫描电子显微镜(SEM)观察样品表面形貌和分析样品表面元素含量；X射线衍射仪(XRD)检测样品表面晶相；表面形貌仪检测样品表面粗糙度；X射线光电子能谱(XPS)检测表面元素化学状态。2.采用亚甲基蓝降解实验分析UVA和UVC两种不同波段紫外线照射对微弧氧化纯钛表面的光催化降解能力;采用模拟体液浸泡方法测定UVA和UVC两种不同波段紫外线照射对微弧氧化纯钛表面磷灰石诱导能力的影响。3.采用蛋白吸附试验分析UVA和UVC两种不同波段紫外线照射微弧氧化纯钛表面对蛋白吸附的影响；通过荧光染色和扫描电子显微镜研究UVA和UVC两种不同波段紫外线照射微弧氧化纯钛表面对MG-63细胞在材料表面粘附伸展的影响；利用MTS法比较不同波长处理后对细胞增殖的影响；利用ALP试剂盒比较材料表面细胞ALP活性。4.统计学方法采用SPSS13.0统计分析软件,接触角实验每组样本量为3个,每个样本取三个区域；细胞粘附实验每组样本量为3个,每个样本分四个视野摄片；亚甲基蓝降解实验、蛋白吸附试验和其余细胞试验每个组样本量为6个,测定结果均以x±S来表示,组间采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),然后用Levene’s test检验方差齐性(检验水准α=0.05),如果方差齐则进一步对样本均数进行两两比较的LSD检验,反之,如果方差不齐则采用近似F检验的Welch方法进行方差分析后,Dunnett’s T3检验进行两两比较,假设检验为双侧检验,检验水准α=0.05,P<0.05时差异具有统计学意义。结果1.三组钛片经扫描电子显微镜观察表面形貌无差异,均分布着较均匀的孔洞,呈蜂窝状,大小不一,孔径为1-10μm左右；排除C元素的不稳定干扰,三组钛片表面元素主要有Ti、O、Ca、P四种元素,而大部分为Ti、O元素,Ca、P元素的总和占表面氧化膜的比例为8%-15%,Ca/P原子比为1.4-1.6之间；三组钛片表面氧化膜晶型：TiO2均以锐钛矿和金红石形式存在,另外还有高强度的钛基底衍射峰；三组钛片表面粗糙度差异无统计学意义(F=1.204,P=0.327)；XPS分析经UVA和UVC处理的钛片表面C-C和C-H基团明显减少,Ti-OH基团增加；UVA和UVC处理的钛片表面亲水性都明显增加,与单纯微弧氧化纯钛表面差异有统计学意义(F=1431.521,P=0.000)。2.不同波长紫外线对微弧氧化纯钛表面光催化作用降解亚甲基蓝能力：UVA和UVC波长紫外线均会对微弧氧化纯钛表面产生光催化作用使亚甲基蓝降解,溶液的OD值均随时间的延长而减小,MAO+UVC组OD值下降幅度更明显,即降解亚甲基蓝能力更强。模拟体液诱导磷灰石能力：MAO组钛片在模拟体液中浸泡3周后表面有少量散在磷灰石的形成,MAO+UVA组和MAO+UVC组钛片在模拟体液中分别浸泡1w、2w和3w后表面磷灰石的形成有随时间延长有递增的趋势,MAO+UVC组表面形成能力更强。3.各组钛片表面蛋白吸附水平：2h时MAO+UVC组表面蛋白吸附率达到最大值,之后趋于稳定,MAO组和MAO+UVA组表面蛋白吸附率不足10%；MAO和MAO+UVA组表面蛋白吸附率在6h时达到最大值,但最终蛋白吸附率不足20%,各时间段MAO+UVC组和MAO+UVA组、MAO+UVC组和MAO组差异均具有统计学意义(P<0.05),MAO组与MAO+UVA组差异无统计学意义(P>0.05)。扫描电子显微镜观察各组材料表面细胞形态：1h时三组表面细胞均发生粘附,MAO+UVC组表面细胞有少量粗短的伪足向四周伸出；4h时各组材料表面细胞有大量突起向四周伸展,很多突起深入钛片表面微孔内部,与材料表面形成机械锁和,MAO+UVC组表面细胞则伸出大量粗壮的伪足,整个细胞向多角形发展；24h时MAO组和MAO+UVA组表面细胞呈薄层状平铺于材料表面,MAO+UVC组表面细胞与微弧氧化纯钛表面更加融合,细胞边界不明显,与材料融为一体。三组材料表面细胞粘附率在1h、2h、4h三个时间段均随时间的延长呈递增趋势,各时间段MAO+UVC组和MAO+UVA组.MAO+UVC组和MAO组差异均具有统计学意义(P<0.05),MAO组与MAO+UVA组差异无统计学意义(P>0.05)。不同波长紫外线照射微弧氧化纯钛表面对成骨细胞增殖活性的影响：MTS结果：在1d、3d和5d三个时间段各组材料表面的OD值均随时间的延长而增大,各时间段MAO+UVC组和MAO+UVA组、MAO+UVC组和MAO组差异均具有统计学意义(P<0.05),MAO组与MAO+UVA组差异无统计学意义(P>0.05)。不同波长紫外线照射微弧氧化纯表面对成骨细胞ALP分化能力的影响：ALP结果：各组材料表面的OD值第7d比第3d有明显增高趋势,但第14d各组OD值出现下降趋势。第3d组间差异无统计学意义,第7d和14dMAO+UVC组和MAO+UVA组、MAO+UVC组和MAO组差异均具有统计学意义(P<0.05),MAO组与MAO+UVA组差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.UVA和UVC波段紫外线均可以使微弧氧化纯钛表面亲水性增强和表面能提高,均可以减少微弧氧化纯钛表面碳氢化合物,而使Ti-OH的含量增加,其中UVC波段紫外线效果更加显著,但两波段紫外线均不会影响微弧氧化纯钛表面形貌、粗糙度、元素组成及TiO2晶型。2.UVA和UVC波段紫外线激发微弧氧化纯钛表面光催化作用均具有降解能力,UVC降解能力更强；两波段紫外线处理的微弧氧化纯钛表面生物活性都得到提高,其中UVC处理的表面更有利于磷灰石的形成。3.UVC较UVA处理的微弧氧化纯钛表面更明显地增加了蛋白的吸附,利于MG-63细胞在其表面的粘附、伸展、增殖和分化。