应用DNA-纳米金探针的目视化甲型肝炎病毒检测基因芯片的研究

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  甲型肝炎病毒(HAV)分布于全世界,是一种主要的急性传染性肝炎。HAV属于细小RNA病毒,它的基因为单股正链RNA。甲型肝炎病毒的传播途径简单,主要为粪一口途径。人们常通过不洁饮食,饮水和生活接触感染,因此,有必要发展特异和高效的检测方法来检测临床和生物HAV标本。   基因芯片技术具有高特异性、高灵敏度、高通量的特点,为临床和环境检测提供了良好的应用前景。目前通用的基因芯片技术有多种,但分别都存在着或者灵敏度不高,或者检测技术复杂,或者条件和设备要求高的问题限制了该技术在临床检测中的应用。   本实验室将芯片技术和纳米技术的有机结合在一起,以充分利用纳米金与银反应可将信号放大106倍的优势,建立了应用纳米金探针的目视化HAV基因芯片技术。近几年来,应用纳米金标记代替目前通用的荧光、同位素、酶标等信号报告材料在核酸检测中比较普遍。许多实验表明,纳米金将会是个很好的标记替代物,并且DNA-纳米金探针由于其具有高稳定性,高标记密度与及高敏感性会特别适合于核酸检测基因芯片的应用。   目视化纳米金探针HAV检测基因芯片技术的主要原理是:3’端-SH基修饰的寡核苷酸与纳米金颗粒标记作为检测探针,5’端-NH2修饰的寡核苷酸基因探针与硅烷化玻片共价连接作为捕获探针。捕获探针按预先设计的阵列点样在处理好的玻璃基片上,再与待检测的HAV扩增目的核酸片段以及检测探针以双探针夹心方式杂交,再进一步进行银染加强显色,用肉眼观察或用平面扫描仪分析结果。   本实验室已初步建立了使用纳米金探针的乙丙型同步检测肝炎芯片,在这个实验基础上,进一步优化了HAV的捕获探针的浓度,纳米金探针的用量,银染时间以及封闭剂的选择,建立了目视化HAV基因芯片,并探讨了HAV基因芯片的检测灵敏性,在银染12分钟的情况下可以检测100fMHAVamplicon。本文还对小量HAV临床标本进行了检测,结果与ELISA检测抗-HAVIgM结果无显著性差别。   以上实验结果显示该芯片检测技术灵敏度高,特异性好,低成本,操作方法简单,所设计的检测内容达到实用化的水平,具有较好的临床应用前景。
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