论文部分内容阅读
本试验通过建立肉仔鸡免疫应激模型并饲喂黑沙蒿多糖（AOP）,探讨AOP对肉仔鸡免疫应激的缓解作用,并利用体内法和体外法相结合,探讨AOP缓解免疫应激反应的机制。主要研究内容及结果如下:试验一:黑沙蒿多糖的提取优化、分离纯化、结构表征和体外活性的研究试验一共包含两部分。试验（1）:采用热水浸提的方法,以水浴时间、水浴温度和料液比进行单因素实验,以AOP得率为响应值,采用响应面法优化AOP的提取条件,采用离子色谱和凝胶色谱法检测AOP分子量及单糖组成。结果表明:AOP的最佳提取条件为:液料比15:1 m L/g,提取时间4.3 h,提取温度60℃。在此条件下,AOP的得率和含糖量分别为5.56%和52.65%;AOP的平均分子量为2.1 k Da（62.6%）和1.5 k Da（37.4%）,由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成,其摩尔比为6.87:10.67:54.13:2.49:18.37:4.83:2.64;此外,AOP具有较好的体外益生作用和抗氧化能力。试验（2）:使用DEAE-52阴离子交换柱和葡聚糖凝胶进一步分离纯化AOP,采用离子色谱、凝胶色谱法和甲基化法检测纯化AOP的分子量、单糖组成和键合结构。结果表明:经过DEAE-52阴离子交换柱层析和葡聚糖凝胶柱层析得到AOP-Ⅰ,其平均分子量为9.00 k Da,是由岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸组成的一种中性多糖,其摩尔比分别为0.56:13.75:12.79:54.08:3.15:13.43:0.63:0.67:0.93;AOP-Ⅰ主要由尾端葡萄糖基、→5)-Ara（f）-（1→、→3）-Gal（p）-（1→、→2）-Gal（p）-（1→、→4）-Man（p）-（1→、→6）-Man（p）-（1→、→4）-Gal（p）-(1→和尾端阿拉伯糖基按66.43:1.55:4.81:3.19:6.48:6.74:9.17:1.65的摩尔比构成。试验二:黑沙蒿多糖对肉仔鸡免疫和抗氧化功能的影响本试验采用单因子随机区组试验设计,选取288只1日龄AA肉仔鸡,随机分为6个处理,每个处理6个重复,每个重复8只鸡。其中对照组饲喂基础日粮,试验组在基础日粮的基础上分别添加250、500、750、1000 mg/kg AOP和50 mg/kg金霉素,试验期42 d。结果表明:AOP添加剂量在750 mg/kg时,对肉仔鸡生长、免疫及抗氧化功能的调控效果较为明显,有望替代金霉素在肉仔鸡日粮中的使用。试验三:黑沙蒿多糖对肉仔鸡免疫应激的缓解作用及其分子调控机理研究根据试验二的结果,综合生长、免疫和抗氧化指标确定AOP在肉仔鸡日粮中的适宜添加量,作为本试验日粮中AOP的添加量。通过腹腔注射LPS构建肉仔鸡的免疫应激模型,采用2×2因子试验设计,选取192只1日龄AA肉仔鸡随机分为4个处理,6个重复,每个重复8只鸡。试验期为42 d,分为预饲期（0-14 d）、应激Ⅰ期（15-21 d,LPS注射期）、恢复Ⅰ期（22-28 d）、应激Ⅱ期（29-35 d,LPS注射期）和恢复Ⅱ期（36-42 d）。处理1和处理2饲喂基础日粮,处理3和处理4饲喂试验日粮（基础日粮中添加适宜剂量的AOP）。分别在应激Ⅰ期（试验第15、17、19、21 d）和应激Ⅱ期（试验第29、31、33、35 d）给处理1和处理3组的肉仔鸡腹腔注射5 m L/kg体重的LPS溶液（LPS溶液浓度为100μg/m L生理盐水）,处理2和处理4组注射等量的生理盐水。结果表明:日粮中添加AOP可通过提高肉仔鸡蛋白质表观代谢率,降低血清应激激素和促炎细胞因子含量来缓解LPS导致的生长性能的下降;日粮中添加AOP通过抑制TLR4/NF-κB信号通路降低LPS诱导的促炎因子的过量产生;通过激活Nrf2/Keap1信号通路,减轻LPS诱导的抗氧化酶活性下降,从而缓解肉仔鸡的免疫应激和氧化损伤。试验四:黑沙蒿多糖对肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫应激的缓解作用本试验采用2×7因子设计,即主效应包括2个应激状态（非应激组:不添加LPS;应激组:添加LPS,添加量为10μg/m L）和6个AOP-Ⅰ添加水平（0、50、100、150、200和250μg/m L）和维生素A（VA）添加组,共设14个处理,每个处理6个重复。结果表明:非应激条件下,AOP-Ⅰ在体外具有显著的免疫调节及抗氧化功能;应激条件下,AOP-Ⅰ可缓解由LPS导致的免疫应激,且缓解作用与VA相当;150μg/m L AOP-Ⅰ可作为体外研究其免疫和抗氧化调节机制的适宜添加量。试验五:黑沙蒿多糖通过TLR4/NF-κB途径对肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫应激的缓解作用及其机理研究试验五共包括三部分。试验（1）:采用完全随机试验设计,分为六个处理组:空白对照组、LPS组、LPS+TAK-242组、AOP-Ⅰ组、AOP-Ⅰ+TAK-242组、TAK-242组,每个处理六个重复。结果表明:TLR4是AOP-Ⅰ发挥免疫调节作用的候选靶点。试验（2）:采用完全随机试验设计,分为六个处理组:空白对照组、FITC-LPS组、LPS+FITC-LPS组、LPS组、AOP-Ⅰ+FITC-LPS组、AOP-Ⅰ组,每个处理六个重复。结果表明:AOP-Ⅰ具有干扰LPS与细胞表面受体结合的作用。试验（3）:采用完全随机试验设计,分为八个处理组:对照组、AOP-Ⅰ组、AOP-Ⅰ+PDTC组、PDTC组、LPS组、AOP-Ⅰ+LPS组、LPS+PDTC组、LPS+PDTC+AOP-Ⅰ组,每个处理六个重复。结果表明:非应激状态下,AOP-Ⅰ可通过激活TLR4/NF-κB信号通路进而发挥其免疫调节作用;应激状态下,AOP-Ⅰ可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的过度激活进而缓解PBLs的免疫应激。试验六:黑沙蒿多糖通过Nrf2/Keap1途径对肉仔鸡外周血淋巴细胞免疫应激的缓解作用及其机理研究本试验采用完全随机试验设计,分为八个处理组:对照组、AOP-Ⅰ组、AOP-Ⅰ+ML385组、ML385组、LPS组、AOP-Ⅰ+LPS组、LPS+ML385组、LPS+ML385+AOP-Ⅰ组,每个处理六个重复。结果表明:非应激状态下与应激状态下,AOP-Ⅰ均可通过激活Nrf2/Keap1信号通路发挥其免疫调节作用。