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星状病毒(Astrovirus)是感染哺乳动物和鸟类的病原体,属于星状病毒科(Astroviridae),基因组为不分节段的正链RNA,无囊膜且核衣壳为20面体结构,形状为星状。人星状病毒(Human Astrovirus,HAstV)基因组含三个开放阅读框,分别编码病毒非结构蛋白nsP1a、nsP1b及衣壳蛋白的ORF2。人星状病毒通过粪口途径侵染宿主,主要造成婴幼儿及儿童的腹泻、下腹疼痛等症状,是继轮状病毒后第二大能引起胃肠炎的病原。在儿童病毒性腹泻中,HAstV的全球感染率约10%;根据我国1998~2005年的七个地区流行病学调查报告来看,HAstV感染率为5.5%,某些在高发季节可达36.2%,而暴发性腹泻中病毒检出率则高达70%。HAstV分成8个血清型,根据ORF2蛋白区一个长为348bp的核苷酸片段又分为八个基因型,这八种血清型与八个基因型之间是完全对应的。我国目前HAstV优势流行株为I型。目前,由于对人星状病毒研究较少,病毒感染和复制机制尚不清楚,通常病毒非结构蛋白在病毒感染、复制过程中发挥重要的作用。HAstV nsP1a蛋白在病毒感染早期被蛋白酶切割成四个片段,其中nsP1a/3含有蛋白酶基序。通常病毒蛋白酶和宿主细胞靶蛋白相互作用,参与病毒的感染及复制,如HCV蛋白酶。多聚蛋白前体的水解是人星状病毒复制的关键,而这个过程需要ORF1a编码的蛋白酶的水解作用,因为nsP1a/3含有蛋白酶基序,很可能在此过程发挥了重要的作用,但nsP1a/3与宿主细胞相互作用的靶蛋白还不清楚。本课题旨在研究nsP1a/3与宿主细胞具体作用的靶蛋白,对筛选的蛋白在细胞水平进行过表达初步鉴定,并将目的蛋白免疫大鼠,制备多克隆抗体,为进一步nsP1a/3与宿主细胞靶蛋白相互作用做好铺垫。本研究工作包括三部分:1、宿主细胞与nsP1a/3互作蛋白筛选以实验室构建并保存的nsP1a-pEGFP-N2为模版,PCR扩增nsP1a/3基因片段,将该基因插入到经过改造的酵母诱饵载体pGBST7上。nsP1a/3-pGBST7电转化Y2HGold酵母细胞,筛选阳性克隆。鉴定诱饵表达载体表达产物对酵母细胞有无毒性作用及报告基因有无自激活作用。鉴定成功后,采用诱饵酵母Y2HGold与文库酵母Y187共培养的方式,进行酵母双杂交。双杂交后的二倍体细胞涂布SD/-2/X/A平板;从平板上挑取蓝色菌落点种到SD/-4/X/A平板;提取蓝色菌落质粒,转化DH5α,分别涂布Amp+、Kan+抗性平板,提取单菌落质粒,测序。将不同文库质粒分别与诱饵质粒共转化Y2HGold酵母回复杂交,涂布SD/-4/X/A平板,对蓝色菌落文库片段测序,NCBI数据库比对,确定了两种靶蛋白:TMEM120A、ZBRK1。2、体细胞验证nsP1a/3与靶蛋白相互作用体系构建构建诱饵蛋白与靶蛋白基因的标签表达载体,分别为nsP1a/3-pCDNA3.1-Flag、TMEM120A-pCDNA3.1-HA、ZBRK1-pCDNA3.1-HA,分别转染 HEK293T细胞,通过western blot证实所构建的载体能在HEK293T细胞中稳定表达。3、nsP1a/3、TMEM120A、ZBRK1蛋白多克隆抗体制备构建nsP1a/3、TMEM120A、ZBRK1蛋白基因原核表达载体,分别为nsP1a/3-pET-28a、TMEM120A-pET-32a、ZBRK1-pET-28a,用大肠杆菌表达菌株 BL21(DE3)、rosetta表达三个蛋白,western blot鉴定目的蛋白表达。表达条件优化后,大量表达目的蛋白,用HisTrapHPNi2+-NTA柱纯化目的蛋白,再用梯度透析,复性目的蛋白,image J分析SDS-PAGE结果和BCA定量,确定目的蛋白浓度和纯度。将目的蛋白与弗氏佐剂充分混合后腹腔注射SPF级SD大鼠,四次免疫后,腹主动脉取血。ELISA测定抗体效价分别为1:30000、1:64000、1:256000,western blot鉴定结果显示抗体特异性良好。本文成功利用酵母双杂交筛选到两个靶蛋白,构建诱饵、靶蛋白基因的真核表达载体,验证其在HEK293T细胞中能稳定表达。制备了三个蛋白的多克隆抗体,为进一步研究nsP1a/3蛋白的生物学功能奠定坚实的基础。