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C反应蛋白(C-reactiveprotein,CRP)是由肝脏生成的一种急性蛋白,是炎症、心脑血管等疾病的重要指示因子,在临床上有重要的指导作用。目前常用的CRP检测方法中大多以抗体作为识别分子。核酸适配体是一种新兴的识别分子,不仅具有可以比拟抗体的高亲和力及高特异性,同时还具有分子量小、稳定性好、生物相容性好、易于合成和修饰等优点。因此,筛选CRP的核酸适配体,并构建基于核酸适配体的CRP检测方法具有良好的发展前景。目前已有多篇文献报道筛选获得了 CRP的核酸适配体,其中应用较为广泛的是一条RNA的核酸适配体。但是研究表明,该RNA核酸适配体只与CRP的单体结合而不与五聚体结合,并且该RNA核酸适配体也不够稳定。本课题组前期已利用微流控芯片技术筛选获得了CRP的DNA核酸适配体6th-62,其解离常数为22.1 nmol/L。为进一步了解该核酸适配体的性质并拓展其应用,本文对6th-62进行了序列优化及性质考察,并在此基础上发展了两种CRP的检测方法。具体研究内容如下:1.CRP核酸适配体6th-62的序列优化及其性质考察。利用表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技术对核酸适配体6th-62进行序列优化,由于在构建筛选文库时设计了引物端,所以通过截掉全长链的核酸适配体6th-62两端的固定序列得到6th-62-40,结果证明6th-62-40仍然可以和CRP结合。设计了邻近探针进行考察,结果表明6th-62-40能特异地识别靶标CRP。还用SPR考察了不同核酸适配体与目标物的结合位点,结果初步表明6th-62、CRP80-17与CRP的结合位点是一致的;6th-62-40、CRP40-17与CRP的结合位点也是一致的。其中CRP80-17及CRP40-17为本课题组通过氧化石墨烯辅助的免固定筛选法获得的CRP核酸适配体。2.基于核酸适配体和金纳米颗粒标记抗体的三明治型SPR传感器实现了 CRP的高灵敏检测。首先对核酸适配体固定化方式进行了考察,结果表明6th-62-40的3’端固定在金膜上时引起的SPR角度变化最大,故利用该固定化方法构建传感器用于CRP的检测。由于金纳米颗粒与金膜的耦合效应放大信号,显著提高了灵敏度,检测范围为10pmol/L～50nmol/L,检测限为10pmol/L,并表现出高选择性和良好的再生性能,可用于血清样品中CRP的检测。3.基于富G序列的核酸适配体6th-62-40能够增强ThT荧光的性质,发展了免标记的荧光方法检测C反应蛋白。荧光分子硫黄素T(ThT)可以和该富G的DNA序列结合形成ThT/6th-62-40复合物,使ThT的荧光显著增强。当目标物CRP存在时,6th-62-40能与靶标CRP特异性结合,形成CRP/6th-62-40复合物,破坏了ThT/6th-62-40复合物并使ThT处于游离状态,使得ThT的荧光显著降低。基于此原理,本文发展了一种基于核酸适配体的免标记方法用于CRP的检测,线性范围为0.5 nmol/L～20 nmol/L,检测限为380 pmol/L。该方法无需对核酸适配体探针进行标记,具有简便、快速、成本较低等特点。