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糖尿病患者皮肤易损，且一旦出现伤口很难愈合。其原因主要包括：(1)患者全身因素(如代谢营养状况、免疫力等)；(2)伤口局部因素(如是否合并感染、周围组织的血管病变、神经病变等)；(3)伤口微观的改变(过量的基质金属蛋白酶分泌、生长因子缺乏、组织增殖能力降低、微循环的异常、炎症因子分泌过多等)。这些原因最终导致细胞外基质合成和降解的失平衡，从而影响溃疡愈合。
基质金属蛋白酶9(MMP-9)是基质金属蛋白酶(MMPs)家族中的一员，又称明胶酶B，是依赖Zn2+的金属酶。在糖尿病病理状态下：(1)研究发现糖尿病病人的足溃疡渗出液中基质金属蛋白酶9(MMP-9)的水平较正常人升高。(2)本课题组前期研究发现糖尿病大鼠皮肤MMP-9的水平较正常大鼠明显增高，MMP-9/TIMP-1(组织金属蛋白酶抑制剂-1)之间平衡失调，细胞外基质过度降解，可能与糖尿病大鼠伤口愈合减慢有关。(3)在糖尿病足患者中，单纯局部应用生长因子并不能加快溃疡愈合，考虑可能与MMP-9的升高加速降解生长因子、生长因子受体、整合素及其受体，从而加重伤口局部炎症反应，减慢伤口愈合。因此抑制伤口局部MMP-9的表达是促进糖尿病足伤口愈合的可选择方法之一。然而目前还没有特异性MMP-9抑制剂，且MMPs抑制剂(TIMP)价格十分昂贵，不适合临床常规使用，所以，通过RNA干扰技术抑制糖尿病伤口MMP-9的表达成为可供选择的方法之一。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)近年来发展迅速，已经从基础研究发展到临床应用。RNA干扰技术的核心是通过内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失，这种依赖于dsRNA的转录后基因沉默过程被称为RNA干扰。此技术的关键步骤之一就是将基因转导进入细胞的技术。
基因的转导需要高效率、高安全性的载体，由于病毒载体潜在的安全性问题，很大程度限制了其在体内实验中的应用，故人们一直致力寻找新的基因转导载体。非病毒载体中的新型阳离子聚合物目前受到极大关注，因为其具有以下优点：(1)无免疫原性，不会引起机体的免疫反应；(2)通过控制粒径尺寸和表面性质可控制载体的生理行为；(3)可根据需要设计载体的分子结构；(4)遗传物质的释放可做到由聚合物基质的降解速率决定。阳离子聚合物与核酸带负电的磷酸基团通过静电相互作用形成复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过内吞作用进入细胞。中山大学化学与化学工程学院高分子研究所张黎明教授课题组通过分子设计合成星型阳离子聚合物β-CD-PAMAM，该聚合物具有以下优点：(1)具有良好的水溶性和生物相容性；(2)可与siRNA形成纳米粒；(3)表面大量的阳离子基团，提供了进一步功能化的可能。但该聚合物生物安全性、对siRNA的结合和转导能力如何还不明确。β-CD-PAMAM的化学结构如下：
研究目的:
1.了解β-CD-PAMAM的细胞毒性。
2.探讨β-CD-PAMAM与MMP-9特异性siRNA的结合能力。
3.β-CD-PAMAM介导FAM标记的siRNA转染效率评估。
4.β-CD-PAMAM介导的RNAi对大鼠皮肤成纤维细胞CRL1213MMP-9抑制效果评估。
材料与方法:
所用细胞为大鼠皮肤成纤维细胞株CRL1213(编号4032860)，购自美国组织培养库(ATCC)。
1.β-CD-PAMAM的细胞毒性实验(MTT法)
将大鼠皮肤成纤维细胞株CRL1213分为正糖培养组(5.6mmol/L)和高糖培养组(25mmol/L)，每种糖浓度组再根据β-CD-PAMAM的终浓度分为21.3ug/ml、16.0ug/ml、10.7ug/ml、5.3ug/ml、2.1ug/ml及空白对照组，每组设五个复孔，加入β-CD-PAMAM后24h、48h、72h测各组在492nm的OD值。细胞活力(％)=[A492(实验组)/A492(对照组)]×100，实验重复三次结果取平均值。
2.琼脂糖凝胶电泳检测新型阳离子聚合物β-CD-PAMAM与siRNA结合能力β-CD-PAMAM与MMP-9特异性siRNA按照质量比40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、4∶1混合后行琼脂糖凝胶电泳，带正电荷的聚合物与带负电的siRNA会通过电荷作用互相结合，若阳离子聚合物的量足够，会与siRNA充分结合，则琼脂糖凝胶电泳显示siRNA被阻滞在上样孔内，或向负极泳动。
3.β-CD-PAMAM介导FAM标记的siRNA转染效率评估
将大鼠皮肤成纤维细胞株CRL1213分为正糖培养组(5.6mmol/L)和高糖培养组(25mmol/L)，在每种糖浓度下，β-CD-PAMAM与siRNA按照质量比分为40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、4∶1组，同时设Lipofectamine2000与siRNA混合组。转染后24小时内通过激光共聚焦显微镜观察转染效果，流式细胞仪检测转染效率及细胞死亡数，筛选出转染效率最优体系。实验重复三次结果取平均值。
4.β-CD-PAMAM介导的RNAi对大鼠皮肤成纤维细胞CRL1213MMP-9抑制效果评估
将大鼠皮肤成纤维细胞株CRL1213分为正糖培养组(5.6mmol/L)和高糖培养组(25mmol/L)，行qRT-PCR检测MMP-9表达。高糖+脂多糖(LPS)1ug/ml18小时刺激建立MMP-9高表达细胞模型后再次行qRT-PCR检测MMP-9表达。然后将筛选出的β-CD-PAMAM介导的转染效率最优体系和Lipofectamine2000介导的转染体系转染细胞，24小时后行qRT-PCR检测MMP-9表达。评价β-CD-PAMAM介导的RNAi对大鼠皮肤成纤维细胞CRL1213MMP-9抑制效果。实验重复三次结果取平均值。
5.统计学分析
实验数据采用SPSS16.0统计学软件进行分析。计量资料用均数±标准差表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，多组间两两比较用Bonferroni法。P＜0.05为具有统计学差异。
结论:
新型阳离子聚合物β-CD-PAMAM毒性较低，可与MMP-9特异性siRNA结合高效率的转染细胞，并能介导目的基因表达抑制。提示其可能作为一种新型的基因载体。