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目的近年来,抗肿瘤免疫治疗作为手术、化疗、放疗后的一种重要辅助治疗手段,日益成为医学界关注的焦点,已在多种肿瘤的临床治疗试验中呈现出了良好的应用效果。然而,抗肿瘤免疫治疗的疗效尚有诸多需要改进的方面,因此我们需要引进新的技术和方法以进一步提高抗肿瘤免疫治疗的疗效。顺磁性纳米铁颗粒作为一种纳米材料,具有体积小、表面积大等诸多特殊理化性质,可携带多种生物分子穿越生物屏障,将蛋白、多肽、药物等物质带到效应器官及细胞内。在本研究中,我们构建了顺磁性铁纳米颗粒与肿瘤蛋白的共价复合物(SPIO-protein complex),用其来刺激人外周血淋巴细胞,在体外评价了顺磁性氧化铁纳米颗粒对调节由肿瘤裂解蛋白所诱发的针对人乳腺癌细胞(MCF-7)的抗肿瘤免疫反应的影响,并评估了纳米颗粒对人乳腺癌细胞(MCF-7)的影响。方法将经过表面处理的纳米铁颗粒与肿瘤裂解蛋白在催化剂碳二亚胺(EDAC)和琥珀酰亚胺(NHS)作用下,在质量比为1：1的条件下进行共价连接形成纳米铁-蛋白复合物；抽取健康志愿者外周血,用人淋巴细胞分离液进行常规分离,得到外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC),进行原代培养；用细胞裂解液裂解人乳腺癌细胞MCF-7,提取细胞裂解蛋白(tumor lysate protein);用裂解蛋白、纳米铁、纳米铁-蛋白复合物分别刺激PBMC,再将刺激后的PBMC与MCF-7细胞相混合,用MTS方法检测对肿瘤细胞的杀伤率。为评估纳米铁本身的毒副作用,将不同浓度的纳米铁溶液,分别与一定量的MCF-7共孵育3天,用MTS试剂检测肿瘤细胞存活状况。结果1)纳米铁可通过羧胺反应与60%的肿瘤裂解蛋白形成共价连接,并形成新型的纳米颗粒,通过电镜和粒径观察发现,连接前后形态和尺寸发生了明显变化。2)MTS杀伤结果显示,与单纯的肿瘤蛋白相比,在纳米铁-肿瘤蛋白复合物浓度为1μg/ml和10μg/ml时,杀伤率分别提升了39%和20%(p<0.05),进而说明纳米铁-肿瘤蛋白的复合物能够显著提升PBMC对MCF-7细胞的杀伤,3)本实验中所用的纳米铁的安全性较好,在0.1-100μg/ml的浓度范围内,对MCF-7无直接杀伤作用。结论顺磁性纳米颗粒与肿瘤蛋白共价偶联后,在体外能够显著增强PBMC对人乳腺癌细胞的杀伤作用,因而可能在抗乳腺癌的免疫治疗中具有潜在的应用价值。目的白血病是一种严重威胁人类生命健康的血液系统恶性肿瘤。作为癌症辅助治疗手段之一的抗肿瘤免疫疗法,为白血病的治疗提供了新的途径,而树突状细胞(dendritic cells, DC)疫苗更是其中颇具前景的一种免疫治疗方法。Wilms’tumor1(WT1)基因在多种白血病细胞中异常地高度表达,其产物被认为是一种有治疗潜力的新型白血病抗原。目前,已有将WT1抗原刺激后的DC(WT1-DC)用于白血病治疗的临床试验报道。在此基础上,如何能进一步提升WT1-DC疫苗的疗效,是当前白血病治疗领域的一个研究热点。已有研究表明,聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid, PLGA)包裹肿瘤抗原后,可以增强肿瘤抗原的免疫原性,并显著提升针对肿瘤的特异性免疫杀伤效应。但迄今为止,尚未有将PLGA微球运用于白血病DC疫苗的研究报道。为探索基于纳米技术的白血病治疗新策略,本课题拟研究承载WTI抗原的PLGA微球对白血病DC疫苗的刺激作用,评估PLGA微球对DC所介导的特异性抗白血病免疫反应的影响,探索其是否能够改善现有WT1-DC疫苗的抗白血病免疫效应。方法采集健康志愿者的外周血,从外周血中提取DNA,通过PCR方法进行人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)检测,选择HLA-A2阳性志愿者,将其外周血采用常规方法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC),去悬浮法得到单核细胞后,加入含有重组人巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白介素-4(rhIL-4)的RPMI1640完全培养基诱导培养出DC。通过“水相—油相—水相”的结构形成包裹有肿瘤抗原和CpG佐剂的PLGA微球,用单双光子共聚焦显微镜和动态光散射仪对PLGA微球进行表征观察；用PLGA微球刺激DC后,在激光共聚焦显微镜下观察DC对抗原的吞噬情况；在体外用负载不同形式复合物的DC刺激同源PBMC,用CFSE荧光标记法检测PBMC对NB4白血病靶细胞的特异性杀伤作用,同时用分泌型人IFN-γ酶联免疫吸附方法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测IFN-y的产出,对细胞杀伤的实验结果进行验证。结果1)鉴于本实验选取的WT1抗原由HLA-A2分子递呈,我们通过PCR技术筛选了献血者的HLA分型。在琼脂糖凝胶电泳结果中,HLA-A2阳性的样本在600bp处呈现明显条带,而HLA-A2阴性样本无此条带；2)所构建的包裹有WT1和CpG的PLGA微球,对WT1和CpG的包裹率分别为50.59%和77.9%;3)用动态光散射仪对上述微球进行表征,发现微球尺寸呈单峰分布,其平均直径为1.5μm；4)以激光共聚焦影像评估DC对微球的吞噬,发现含FITC的微球可进入DC并在DC胞浆中呈均匀分布；5)免疫杀伤实验显示,比起WT1抗原自身,承载WT1抗原的PLGA微球(称为MP (WT1))可诱发更强的、针对靶细胞的免疫杀伤效应(p<0.05)；而同时承载WT1多肽抗原和佐剂CpG的PLGA微球(称为MP(WT1+CpG)),又可进一步提升针对靶细胞的免疫杀伤效应(p<0.05);6) PLGA微球同时包裹WT1和CpG时,WT1和CpG的浓度分别为1μg/ml和2μg/ml时,杀伤效果最好；7) ELISA实验显示,经过MP(WT1+CpG)刺激后,淋巴细胞分泌IFN-γ的分泌量为17.8ng/ml,显著高于MP(WT1)组(p<0.05)；8)特异性免疫杀伤实验显示,MP(WT1+CpG)微球所提升的抗肿瘤免疫效果,对WT1阳性/HLA-A2阳性的NB4白血病细胞具有特异性,对WT1阴性/HLA-A2阳性的U973细胞以及WT1阳性/HLA-A2阴性的K562细胞的杀伤无显著增强。结论PLGA微球共包裹WT1多肽抗原和CpG佐剂后,能够显著提升DC所介导的对人早幼粒白血病细胞NB4的特异性免疫杀伤作用。上述结果提示,该技术可能在改善现有WT1-DC疫苗的抗白血病免疫效应方面具有潜在的应用价值。