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七鳃鳗属脊椎动物亚门(Chordata),圆口纲(Cyclostomata),七鳃鳗科(Petromyzoniformes),是无颌脊椎动物的代表,处于无脊椎动物与脊椎动物之间,有着独特的进化地位。因可变淋巴受体(variable lymphocyte receptor,VLR)介导的适应性免疫防御系统,受到免疫学家的广泛关注。本研究利用生物信息学手段分析日本七鳃鳗(Lampetra japonica)VLRB开放阅读框c DNA(Lja-VLRB),分析结果显示VLRB开放阅读框长822bp,编码274个氨基酸,分为6个结构域,分别是SP、LRRNT、LRR1、LRRV1、LRRV2、LRRCP、LRRNT。对核酸和氨基酸序列各结构域保守性进行计算,结果显示LRRNT、LRR1和LRRCT结构域保守性最高,为75%、76%、78%。经抗原表位软件预测结果显示LRRNT、LRR1和LRRCT都有抗原结合表位。由于LRRCT端以糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidyl-inositol,GPI)结合旳形式锚定在细胞膜上不利于抗原结合,最终选定LRRNT和LRR1结构域序列作为制备抗VLRB抗体的抗原序列。利用Primer5软件设计含酶切位点及酶切位点保护碱基的扩增引物,成功克隆出七鳃鳗VLRB分子的N端抗原序列。采用嵌套高保真酶PCR扩增技术将Lja-VLRB分子的N端抗原序列与p ET-32a(+)连接,构建Pet-32a-Lja-VLRB重组质粒。将重组质粒导入E.Coli Rosetta表达菌诱导蛋白表达并纯化。经质谱检测后将纯化的Lja-VLRB分子N端抗原序列重组蛋白做为抗原多次加强免疫新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体,采用耳缘动脉取血的方式将抗血清分离并纯化。经ELISA检测抗体效价,达到1:1024000。纯化后多克隆抗体利用抗His标签抗体经免疫印迹法检测结果显示无论对重组蛋白还是天然蛋白都具有较强特异性。使用混合菌、LPS、PHA、免疫刺激七鳃鳗,24h时间点处死。通过Western blotting实验检测免疫刺激前后Lja-VLRB在各组织中蛋白水平的表达变化,结果表明免疫前Lja-VLRB在白细胞,髓样小体,鳃组织中均有表达,且白细胞中的表达量高于其它两个组织。混合菌免疫后,髓样小体中Lja-VLRB蛋白表达量显著上调(P<0.05)约是空白对照的2倍,白细胞中Lja-VLRB蛋白表达量显著上调(p<0.05)约是空白对照的1.5倍,鳃组织表达量几乎不变,结果表明当外来病原体入侵Lja-VLRB参与了七鳃鳗的免疫应答反应。经LPS免疫后,白细胞中Lja-VLRB蛋白表达量呈现出极显著上调(P<0.01)约是未免疫时的4倍,鳃组织和髓样小体中Lja-VLRB蛋白表达量显著上调(P<0.05)约是未免疫时的2倍。LPS可以通过刺激B淋巴细胞增殖分化,增强抗原提呈能力。且Lja-VLRB在外周血淋巴细胞中广泛表达,在LPS介导的免疫应答反应中外周血淋巴细胞中的Lja-VLRB发挥重要免疫作用。髓样小体是VLRB+发育成熟的主要场所,所以受外来病原体侵袭后髓样小体中表达量会显著增加。鳃组织是VLRA+淋巴细胞主要分布的组织,但是VLRB+淋巴细胞也有相当的分布。经LPS刺激后Lja-VLRB表达量显著增加,可能表示VLRB和VLRA在行使免疫功能时具有协同作用。经PHA免疫后髓样小体中Lja-VLRB蛋白表达量出现显著上调(P<0.05)约是空白对照的2.5倍,白细胞中表达量显著上调(P<0.05)是空白对照的2倍,鳃组织中表达量变化不明显(P>0.05)。先前有研究表明PHA通过与T细胞表面的丝裂原受体相结合来诱导T细胞的活化与增殖。经PHA刺激后应该是与T淋巴细胞相似的VLRA+淋巴细胞发挥免疫作用,有研究表明七鳃鳗经PHA免疫后VLRA在鳃中表达量明显升高。但本研究结果显示经PHA免疫后Lja-VLRB在白细胞和髓样小体中表达量上调,鳃组织中表达量基本不变,说明PHA刺激后,激活的VLRA信号通路可能会继续激活VLRB淋巴细胞增殖分化为浆细胞样大淋巴细胞产生VLRB抗体参与免疫活动。我们初步研究了VLRB分子在免疫应答过程中的作用,为后续深入研究VLRB分子功能,制备新型替代抗体奠定了基础。