本论文分为两部分:米曲霉尼古丁降解关键酶及其基因的分子生物学;地衣芽孢杆菌Levan蔗糖酶产物特异性的分子机制研究。（一）米曲霉尼古丁降解关键酶及其基因的分子生物学尼古丁是烟草中最主要的生物碱,作为一种剧毒7N-杂环化合物,也是导致烟瘾的主要原因。烟草工业每年产生大量含高浓度尼古丁的烟草废弃物,因尼古丁极高的水溶性,易进入地下水系统而破坏土壤生态平衡,目前已表现出一定的生态毒理危害。许多生长在烟叶及其栽培土壤中的微生物能够利用尼古丁作为碳源和氮源,这些高效的尼古丁降解微生物因其在烟草废弃物脱毒方面的潜力而备受关注。尼古丁降解途径因微生物种类不同而有差异,目前多种尼古丁降解细菌被相继报道,包括嗜烟碱节杆菌（Arthrobacter nicotinovorans）,恶臭假单胞菌（PseudomonasputidaS16）和苍白杆菌（Ochrobactrum sp.Strain SJY1）等。细菌中阐明了三种尼古丁降解途径:节杆菌属的尼古丁降解始于吡啶环羟基化生成6-羟基-L-尼古丁（6-HN）,即吡啶途径;假单胞菌属的尼古丁降解始于吡咯环脱氢生成N-甲基麦斯明（NMM）,即吡咯途径;其它细菌则通过VPP途径降解尼古丁,即通过吡啶途径生成的6-羟基假氧化尼古丁（6-HPON）,随后转化为6-羟基-3-琥珀酸吡啶（HSP）而进入吡咯途径。细菌中参与吡啶途径和吡咯途径的酶已经被详细阐明,参与VPP途径的几例同工酶也被相继报道。相比之下,尼古丁降解真菌仅有几例报道,即小孢子菌属（Microsporum gypseumATCC11395）,丝核薄膜革菌（Pellicularia filamentosa JTS-208）,刺孢小克银汉霉菌（Cunninghlamela echinulata IFO-4444）和本实验室报道的米曲霉（Aspergillus oryzae 112822）。真菌尼古丁降解始于尼古丁N-去甲基化生成去甲基尼古丁,目前对前三种真菌尼古丁降解途径的描述仅限于第一步,并且尼古丁去甲基酶未见报道。本实验室前期研究中,通过对尼古丁代谢产物的分析,首次在国际上提出了一条较详细的真菌尼古丁降解途径,即A.oryzae 112822去甲基途径,然而参与该途径的酶及其基因还未揭示,其分子机制仍然未知。本论文针对A.oryzae 112822的尼古丁去甲基途径进行了比较转录组分析,从整体水平上推测真菌尼古丁降解的分子机制。在尼古丁诱导下,A.oryzae 112822作出了复杂的代谢调整,涉及脱毒、转运、氧化应激反应并伴随增强的能量投入以应对尼古丁耐受和降解,基于深度信息分析提出了A.oryzae 112822尼古丁降解的分子模型。基于差异表达基因（DEG）分析、反应特征分析、多序列比对和进化树分析,筛选出15个潜在参与尼古丁 N-去甲基化的候选cyp基因,即 cyp577A4,cyp613D1,cyp584E5,cyp53A13,cyp548D3,cyp684A2,cyp52G4,cyp55A5v2,cyp5113A1,cyp531C3,cyp620H2,cyp573A5,cyp58K1,cyp5095A1和cyp5080B2;推测催化去甲基尼古丁吡咯环脱氢的是具有Rossman motif的胺氧化酶,由8.78倍上调的基因A0090023000011编码;推测催化NMN吡啶环α位sp2碳原子羟基化的是具有[2Fe-2S]簇、FAD和Moco结合结构域的钼喋呤羟化酶,由xdh基因A0090003001099编码;推测催化2-HNMN吡啶环β-羟基化的是具有GXGXXG,（D/E）XXIGADG和GDA（A/C）H保守指纹序列的N-杂环芳香羟化酶,由4.29倍上调的基因A0090102000087编码。这些潜在参与尼古丁去甲基途径的候选基因是A.112822尼古丁降解研究的主要靶标,为进一步揭示丝状真菌尼古丁降解的分子机制奠定了基础。A.112822尼古丁降解始于尼古丁N-去甲基化生成去甲基尼古丁,在烟草和人体的尼古丁代谢途径中也存在尼古丁 N-去甲基化,并且都是由细胞色素 P450 单加氧酶（CYP82E4,CYP82E5v2,CYP2A6 和 CYP2B6）催化的。CYP是存在于各种生物体中的一类包含血红素铁的单加氧酶超家族,广泛参与药物和异源有毒化合物的脱毒。米曲霉尼古丁初始降解需要O2和NADPH,这正是CYP催化反应的特征,因此推测A.oryzae 112822尼古丁 N-去甲基化由某个特定CYP催化。在A.RIB40参考基因组中,共有142个cyp基因被注释,将烟草尼古丁去甲基酶CYP82E4比对到米曲霉数据库,序列同源性最高仅为27%,CYP620H1,CYP620H3 和 CYP620H2 占据前三位。为了锁定 A.oryzae 1 12822尼古丁去甲基酶,前期对A.112822的尼古丁去甲基酶进行了部分纯化和肽指纹图谱分析,与米曲霉CYP数据库进行比对后发现有9个CYP的匹配率超过 10%,即CYP5113A1,CYP6001C12,CYP51F1,CYP6001A1,CYP620H1,CYP577A4,CYP5109A1,CYP531C3 和CYP55A5v2,其中 CYP577A4,CYP55A5v2,CYP5113A1和 CYP531C3同时出现在转录组分析中,另外CYP620H1和转录组分析中的CYP620H2序列同源性高达69.4%。因此我们重点关注 cyp577A4,cyp55A5v2,cyp5113A1,cyp531C3,cyp620H1和 cyp620H2,连同转录组中上调程度较高的cyp613D1,cyp584E5,cyp53A13和cyp548D3在巴斯德毕赤酵母中进行了表达与活性测定,10个cyp候选基因均成功克隆与表达,CYP620H1/KM71休止细胞表现出尼古丁降解能力。此外,在E.coli BL21中成功表达并纯化了来源于米曲霉和酿酒酵母的CPR电子传递蛋白,其活性用马心细胞色素c在550nm进行了测定。通过体外制备CYP620H1/KM71微粒体并添加外源CPR的方式未检测到显著的尼古丁N-去甲基活性。初步推测认为锚定在微粒体膜系统上的CYP与外源CPR之间的电子传递系统可能不完善,没有经过活细胞的有效组织,而毕赤酵母内源CPR含量又很低,因此我们构建了cyp与cpr共表达质粒以期验证CYP对尼古丁的N-去甲基活性并进行酶的生化表征,研究还在进行中。针对A.oryzae 112822尼古丁去甲基途径中NMN吡啶环α位sp2碳原子的羟基化,我们发现这类反应不论吡啶环侧链的长度和种类都由钼喋呤羟化酶催化,该酶一般具有[2Fe-2S]簇,FAD和Moco结合结构域。目前多个钼喋呤羟化酶被证实参与细菌尼古丁和烟酸降解途径中吡啶环的α-羟基化,在N-杂环化合物的生物降解中具有重要作用。因此我们尝试对米曲霉中编码钼喋呤羟化酶的xdh基因进行表达,包括xdh完整编码框和[2Fe-2S]簇（xdh1）、FAD（xdh2）和Moco（xdh3）,考虑到Moco的装配选择了毕赤酵母真核表达系统,通过Western blot分析证实四个目的蛋白均成功表达,这是对真菌XDH蛋白异源表达的首次探索。通过XDH/KM71休止细胞的活性实验,却发现毕赤酵母对照本身对NMN表现出高的代谢能力,因此需要进一步纯化XDH以验证对NMN的α-羟基化活性。与此同时,我们在A.oryzae 112822中构建了 CRISPR-Cas9基因编辑系统,旨在通过细胞体内基因敲除研究候选基因的功能。首先对来源于酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的cas9基因进行密码子优化并融合SV40核定位信号（SV40-NLS）,将合成的序列构建到丝状真菌表达质粒pBARGPE1和pBARGPE1-eGFP,随后用吡啶硫胺（PT）抗性基因ptrA替换pBARGPE1上的bar基因。通过PEG-CaCl2法将线性化的重组质粒转化到A.oryzae 112822原生质体,Cas9核酸酶在三磷酸甘油醛启动子调控下成功表达。通过荧光显微镜共定位观察,发现Cas9-eGFP融合蛋白在SV40-NLS引导下准确定位到细胞核。随后,选择缺陷后分生孢子颜色由绿变白的wA基因（A0090102000545）作为靶标进行米曲霉CRISPR-Cas9系统的活性验证。基于对wA的序列分析选取了三个靶位点,用U6启动子和终止子控制sgRNA在体内的转录并将整个转录框构建到cas9表达质粒。转化后突变菌株通过PT抗性和白孢子表型进行筛选,在sgRNA的靶向作用下出现了阳性菌株,表明CRISPR-Cas9系统在A.oryzae 112822中构建成功。相比于传统的以丝状真菌自发同源重组进行基因敲除的方式,CRISPR-Cas9系统的编辑效率大大提高,为进一步研究A.oryzae 112822尼古丁去甲基途径中关键酶及其基因奠定了基础。（二）地衣芽孢杆菌Levan蔗糖酶产物特异性的分子机制研究Levan蔗糖酶（EC 2.4.1.10）属于糖苷水解酶68家族,以蔗糖为底物合成β（2-6）主链连接的果聚糖,又称为果糖基转移酶。革兰氏阳性菌Levan蔗糖酶催化形成高分子量Levan,而大多数革兰氏阴性菌Levan蔗糖酶主要合成低聚果糖（FOS）。这两类Levan蔗糖酶拥有整体相似的蛋白结构和高度保守的必须氨基酸基序,而革兰氏阳性菌Levan蔗糖酶底物进入通道表面因氨基酸形成突起结构而变得狭窄,据此推测产物特异性与底物进入通道表面结构相关。本实验室报道了一株产生 Levan 蔗糖酶（B1SacB）的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis 8-37-0-1）,以47.5g/L的产率合成分子量高达2.8×104的高聚合度Levan。因此,我们选择位于B1SacB底物进入通道表面的Tyr246,Asn251,Lys372和Arg369进行突变研究,结果表明单个残基的突变显著影响产物聚合度和连接键型。目前还未见Levan蔗糖酶与FOS型受体底物共晶的报道,考虑到果糖基供体和受体对接的结构需要和酶活性腔的几何形状,位于底物进入通道表面的残基可能参与酶和受体的相互作用。因此在Tyr246,Asn251,Lys372和Arg369位点的替换可能削弱这种作用,突变体失去对受体分子的协调和定向,亲核供体攻击受体不同的羟基氧而合成键型改变的糖产物。突变使产物也更容易解离,转糖基反应机制由processive转变为non-processive从而积累聚合度不一的FOS。该研究揭示了Levan蔗糖酶产物特异性的分子机制。