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目的:美国40岁以上人群外周动脉狭窄的患病率为4.3%(任意一侧下肢踝肱指数<0.9),70岁以上人群患病率更高达14.5%。70%的严重下肢缺血患者接受了血管重建治疗,其中只有75%的患者下肢功能得到改善。同时,严重下肢缺血的截肢率与死亡率仍分别高达21.5%和13.5%。在已知的外周动脉疾病诸多危险因素中,吸烟是比高血压、糖尿病等更为重要的外周动脉疾病危险因素,当前吸烟者较不吸烟者外周动脉疾病风险高4.46倍。对于已经患病者来说不戒烟则往往会进展为严重的下肢缺血,需要截肢或行血管重建。作为烟草中最广为人知的有毒成分,尼古丁对血管平滑肌细胞增殖的促进作用早有报道,但其具体分子机制还有待进一步研究。细胞周期异常诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)过度增殖是导致血管闭塞性疾病发生及复发的关键。同时,越来越多研究发现非编码RNA在血管狭窄过程中发挥重要作用,而其如何调控血管平滑肌细胞增殖?其机制是否与介导细胞周期调控相关?均有待阐明。我们的前期研究发现细胞周期蛋白D(Cyclin D,CCND)与细胞G1/S期转换有关并且能够调控血管平滑肌细胞的增殖。微小RNA(MicroRNA,miRNA)hsa-let-7a-5p在大鼠狭窄动脉、静脉中表达均降低。通过生物信息学预测发现长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)linc00665-207、微小RNA hsa-let-7a-5p与CCND1之间存在潜在的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控机制。虽然长链非编码RNA是否参与尼古丁促进动脉狭窄过程的发生还不清楚,但因为尼古丁能够通过上调RelA表达促进血管炎症,同时生物信息学预测又提示RelA有调控linc00665-207表达的可能。据此,我们提出假设:尼古丁通过RelA调控linc00665-207表达进而作为CCND1的ceRNA促使血管平滑肌细胞过度增殖。我们的研究旨在探究linc00665-207是否参与尼古丁介导的血管平滑肌细胞过度增殖及其分子机制。研究方法:在该研究中,CCK-8实验和细胞流式分析用以评估血管平滑肌细胞的增殖水平和细胞周期,划痕实验用以评估血管平滑肌细胞迁移能力,实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹实验用以评估linc00665-207,hsa-let-7a-5p以及CCND1/2的表达,细胞流式分析用以评估血管平滑肌细胞凋亡水平,双荧光素酶报告实验、染色质免疫共沉淀、和RNA结合蛋白免疫共沉淀用以分析linc00665-207,hsa-let-7a-5p以及CCND1/2 mRNA 3’-UTR之间的分子间相互作用。结果:尼古丁显示出比血小板源生长因子更显著的促增殖效果,且在血小板源生长因子处理的血管平滑肌细胞中发现linc00665-207表达较对照组无明显差异,但在尼古丁处理组linc00665-207较对照组显著上调。尼古丁能够促进RelA表达、激活以及核转位。尼古丁刺激联合过表达RelA使linc00665-207和CCND1/2表达显著上调,hsa-let-7a-5p显著下调,血管平滑肌细胞增殖、迁移能力提高,凋亡减少。沉默linc00665-207能够部分恢复尼古丁激活RelA后引起的增殖和CCND1表达改变,不影响CCND2表达、迁移能力和凋亡水平。过表达linc00665-207能够显著下调hsa-let-7a-5p表达和促进CCND1表达,不影响CCND2表达、迁移能力和凋亡水平,过表达hsa-let-7a-5p能够恢复linc00665-207过表达造成的上述改变。双萤光素酶报告实验证实RelA和linc00665-207启动子区域特异性结合,染色质免疫共沉淀实验发现尼古丁能够促进RelA和linc00665-207启动子区域的结合。RNA结合蛋白免疫共沉淀实验证实linc00665-207和hsa-let-7a-5p存在结合关系,对预测的多个位点逐一突变后进行双荧光素酶报告实验,结果证实linc00665-207第1920-1937碱基序列是linc00665-207和hsa-let-7a-5p结合的唯一有效位点。结论:尼古丁相关的血管狭窄与血管平滑肌过度增殖有关,尼古丁引起血管炎症反应,通过上调和激活NF-κB RelA后进一步转录激活长链非编码RNA linc00665-207,linc00665-207 作为 CCND1 的 ceRNA 海绵吸附微小 RNA hsa-let-7a-5p,最终促进血管平滑肌细胞G1/S转换,促进血管平滑肌细胞增殖、导致血管狭窄发生。该研究将为血管狭窄的诊断和治疗提供新的靶点。