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目的:研究全反式维甲酸(RA)对两种不同来源的SH-SY5Y细胞系的诱导分化作用,并鉴定其诱导分化效率,为进一步探讨神经细胞分化机制选择最适合的SH-SY5Y细胞系亚型。
方法:SH-SY5Y细胞系的来源:一株SH-SY5Y细胞系由北京大学医学部干细胞中心惠赠,一株SH-SY5Y细胞系由河北师范大学生命科学院惠赠。将两种不同来源的SH-SY5Y细胞系在同一条件下分别做如下处理:
1细胞培养:SH-SY5Y细胞用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养基,置于37℃,5%CO2、饱和湿度的空气培养箱中常规培养。
2细胞传代:待SH-SY5Y细胞的融合度达到80%～90%时,用胰蛋白酶/EDTA消化液,于37℃条件下消化3～5分钟,弃掉消化液,加入含血清的DMEM培养基终止消化。离心5分钟(1000转/分钟),去上清。用含10%小牛血清的DMEM培养液重悬细胞,按1:2传代。送37℃,5%CO2、饱和湿度的空气培养箱中继续培养。
3生长曲线测定:把两种不同来源的SH-SY5Y细胞分别分为对照组和处理组,各取对数生长期的细胞,以1×105个/L浓度接种于24孔培养板,接种24h后,空白对照组换新鲜含10%FBS的DMEM培养液培养,处理组培养液中加入10μmol/L的RA,连续培养5d,于加RA后1d、3d、5d,用苔盼蓝排除法计数两组活细胞,绘制细胞生长曲线。
4细胞同步化处理:①正常对照:传代后24h换正常传代用培养液,培养24h后收细胞。②饥饿疗法:传代后24h换含1%FBS的DMEM培养液,培养24h后收细胞。用流式细胞仪检测细胞周期的变化,并用X2检验检测其构成比有无差异。
5细胞分组:将不同来源的SH-SY5Y细胞系分别分成四组,A组是空白对照组,细胞在含10%FBS的DMEM培养基中培养,每2天更换一次培养液;B组是RA诱导ld组,传代后24h,换含10%FBS新鲜配置的培养基加入10μmol/L RA继续培养1d;C组是RA.诱导3d组,传代后24h换新鲜配置的培养基加入10μmol/L RA继续培养3d;D组是RA诱导5d组,传代后24h换新鲜配置的培养基加入10μmol/L RA继续培养5d。
6细胞形态学观察:将SH-SY5Y细胞以1×105的密度接种于25ml培养瓶中,A、B、C、D组同时接种,传代后24h及加入RA处理后1d、2d、3d用倒置显微镜观察细胞形态和分化情况,拍照记录用于比较。根据Sandquist法,细胞分化的标志为一个或一个以上轴突长度直径延伸至’胞体2倍以上。
7免疫荧光化学检测NF、MAP-2在细胞分化过程中的表达:取空白对照组和RA诱导5d组,用免疫细胞化学检测NF、MAP-2在SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中的表达情况。
8结果分析:采用SPSS19.0统计软件进行,所有数据以均数士标准差来表示。对各组间数值采用方差分析和t检验。确定P＜0.05为有显著性差异。
结果:
1 RA对SH-SY5Y细胞增殖的影响:细胞生长曲线显示了各组活细胞计数结果:来源于河北师范大学生命科学院的SH-SY5Y细胞株其对照组平均倍增时间为36.12小时;处理组平均倍增时间为42.63小时,其生长速度减慢,抑制率为37.24%。来源于北京大学医学部干细胞中心的SH-SY5Y细胞株其对照组平均倍增时间为38.12小时;处理组平均倍增时间为49.71小时,其生长速度减慢,抑制率为40.39%。
2细胞同步化处理:流式细胞检测分析结果显示,SH-SY5Y细胞经饥饿处理24h后,G2/M%+S%下降了13.25%,增殖期的细胞比例明显少于正常培养组,其差异有显著性(p＜0.05),此时,处于G1期的细胞比例达到81.59%,大量细胞达到同步化。
3分化对SH-SY5Y细胞形态的影响:未分化的两种SH-SY5Y细胞均贴壁生长,胞体均呈现出不规则的圆形、梭型、多边形等形态,大部分细胞有多个短突起,胞核大,核仁清晰。但北京大学医学部干细胞中心惠赠的SH-SY5Y细胞胞体比河北师范大学生命科学院惠赠的SH-SY5Y细胞胞体稍小。经RA处理1d后,河北师范大学生命科学院惠赠的SH-SY5Y细胞形态发生变化,从细胞的两端伸出树突样突起,细胞呈极性状,3d后分化形态更明显,胞体变小,细胞两端伸出的突起变成细而长的轴突样突起,达第5d时突起长度加长并可见部分突起交织成网状。北京大学医学部干细胞中心惠赠的SH-SY5Y细胞分化程度更明显,不仅细胞两端的突起伸展更加明显,而且形成的更多的突起在细胞间形成广泛联系,呈现成熟神经元的表型,尤其在RA处理5d组,几乎所有的细胞都伸出突起,分化成神经元表型,并形成广泛的网状连接。
4免疫荧光化学结果:两种不同来源的SH-SY5Y细胞的空白对照组,MAP2和NF在核周体内均有少量表达,在RA5d组,MAP2和NF的表达均比空白医学部干细胞中心惠赠的SH-SY5Y细胞MAP2和NF的表达比河北师范大学生命科学院惠赠的SH-SY5Y细胞MAP2和NF的表达要高。说明北京大学医学部干细胞中心惠赠的SH-SY5Y细胞的对RA的诱导分化反应更为灵敏,分化更为充分。
结论:
1维甲酸(RA)可抑制SH-SY5Y细胞增殖,并能够诱导SH-SY5Y细胞分化为成熟的神经元。
2两种不同来源的SH-SY5Y细胞在同一条件下却表现为分化程度不同,提示SH-SYSY细胞可能存在着两种亚型。且不同亚型的SH-SY5Y细胞对维甲酸(RA)的诱导分化敏感性不同。
3来源于神经母细胞瘤的SH-SY5Y细胞株伴随多次传代,有自发分化为不同亚型的潜能及返祖现象,因此,在考虑做神经分化实验时,应选择传代次数少的SH-SY5Y细胞株作为模型。