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乳腺癌是当前严重威胁女性健康的主要恶性肿瘤,对它的治疗越来越多的受到人们的关注。目前,临床上治疗乳腺癌的方法有多种,主要有手术、放疗、化疗、内分泌治疗及生物治疗等,对延长患者生存期起到了一定的作用,但是这些方法都有其不足之处,甚至存在较强的毒副作用和并发症。因此,探索乳腺癌临床治疗的新方法和技术是当前生物医学亟待解决的重大问题。声光联合抗癌疗法(Sono-Photodynamic therapy,SPDT)是在光动力学疗法(Photodynamictherapy,PDT)和声动力学疗法(Sonodynamictherapy,SDT)基础上发展起来的一种新的肿瘤治疗方法。目前的研究表明相比于单纯的PDT和SDT,SPDT的抗癌效果更加显著,但其具体的作用机制尚不清楚,还需要进一步的研究。二氢卟吩e6(Chlorine6,Ce6)是一种二代光敏剂,可以天然叶绿素为原料精致提炼获得,具有化学组成单一、水溶性好、肿瘤组织特异性富集高及在正常组织清除速率快等优点。已有的研究证实,Ce6介导的PDT和SDT均有一定的抗肿瘤效应。本论文以中央高校基本科研业务费专项资金项目“ROS在声光联合疗法诱导乳腺癌细胞线粒体自噬中的信号调控”为依托,在实验室前期研究工作的基础上,选择乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7、4T1为细胞模型,Ce6为声敏剂,频率为1.0MHz的平场超声以及激发波长为650nm,输出功率密度为10.4mW/cm2的半导体激光器为辐照光源,研究Ce6介导的声光联合疗法(Ce6-SPDT)对乳腺癌细胞的杀伤作用,并以MDA-MB-231细胞为模型进一步研究了Ce6-SPDT的作用机制;同时以4T1移植瘤小鼠为实验动物模型,应用频率为1.90MHz,LP为3W/cm2的超声以及激发波长为650nm的半导体激光器为辐照光源,研究Ce6介导的声光联合疗法(Ce6-SPDT)对4T1移植肿瘤的杀伤作用,通过免疫组化法检测肿瘤组织内VEGF和MMP9的表达水平的变化,初步探讨Ce6-SPDT对肿瘤生成和转移能力的影响。目前取得的研究结果如下:1.采用MTT法检测发现,在所选的浓度范围内,Ce6对MDA-MB-231不具有细胞毒作用,Ce6-SDT处理时,细胞的相对存活率随Ce6浓度的增加而下降;在所选的光照剂量条件下,单纯光照处理对MDA-MB-231细胞无杀伤作用,Ce6-PDT处理时,细胞的相对存活率随光照剂量的增加而下降,在Ce6浓度为1μg/mL的条件下,1.2J/cm2可能是Ce6-PDT损伤MDA-MB-231细胞的光照剂量阈值;在选定的实验参数下,Ce6介导的声光联合疗法(Ce6-SPDT)对MDA-MB-231、MCF-7、4T1具有一定的协同杀伤效应。2.DAPI染色观察发现,单纯SDT对MDA-MB-231细胞核结构没有明显的影响,单纯PDT对MDA-MB-231细胞核有轻微的损伤,SPDT和PSDT处理后,MDA-MB-231细胞核出现明显的细胞核物质固缩、染色质凝集等凋亡性变化。3.流式细胞仪检测发现,Ce6-SPDT显著地提高了MDA-MB-231细胞的凋亡率,同时可引起MDA-MB-231细胞线粒体膜电位明显下降。4.流式细胞术研究表明,Ce6-SPDT可引起MDA-MB-231细胞中活性氧水平明显升高;活性氧的抑制剂NAC能有效缓解Ce6-SPDT诱导的MDA-MB-231细胞存活能力下降。提示活性氧可能参与了 Ce6-SPDT杀伤MDA-MB-231细胞的过程。5.应用可见光三维活体成像系统对Ce6在4T1移植瘤内的分布情况进行活体示踪分析,发现小鼠尾静脉给药后,Ce6快速富集到肿瘤部位,2h后肿瘤部位的荧光最强,表明此时Ce6在4T1移植瘤内的含量已达到最高,且在2-6h内一直维持较强的荧光,同时也说明Ce6在4T1移植瘤内的代谢速率较慢。尾静脉注射2h后Ce6在肿瘤组织和正常组织内分布的活体成像结果显示,给药后2h,肿瘤内的荧光光子数最高,然后依次是肺、皮肤、肝、胃、心脏、肌肉、小肠、肾和脾。6.研究Ce6介导的声光联合疗法对4T1移植肿瘤的生长抑制作用得知:单纯PDT和单纯SDT表现出一定的肿瘤生长抑制效应,而声光联合处理对肿瘤组织的生长抑制效应明显高于单独PDT组和单纯SDT组,处理后第4天其肿瘤体积基本上维持在对照组小鼠肿瘤大小的一半左右;声光联合处理对肿瘤重量增加也有明显的抑制作用,处理后22天,PSDT组和SPDT组的抑瘤率分别为39.98%和40.37%,显著高于其他三个实验组;比较不同处理组4T1荷瘤小鼠的体重得出,各处理组对小鼠的体重影响不明显。7.通过HE染色结合光镜观察Ce6-SPDT处理后在体4T1肿瘤细胞的显微结构变化,结果表明:单纯PDT和单纯SDT对在体4T1肿瘤组织有一定的杀伤作用,而Ce6-SPDT则严重破坏了 4T1肿瘤细胞的形态结构,其损伤程度明显大于单纯PDT和单纯SDT处理组。8.免疫组织化学法检测Ce6-SPDT处理对4T1肿瘤组织内VEGF表达变化的影响,实验结果显示,SPDT和PSDT处理后,肿瘤组织内VEGF表达显著性降低,说明声光联合疗法可能通过下调VEGF的表达水平进而抑制肿瘤的生长。9.Bouin’s固定液固定各处理组小鼠肺组织,观察Ce6-SPDT处理对肿瘤转移的影响,实验结果显示,PSDT组和SPDT组小鼠肺转移程度明显低于其他处理组,同时免疫组化法检测肿瘤组织内MMP-9表达的结果显示,PSDT组和SPDT组MMP-9表达水平显著性降低,说明Ce6介导的声光联合处理可能通过抑制肿瘤侵袭转移过程中需要的重要蛋白表达,从而抑制肿瘤的转移。本研究选择声敏剂Ce6来研究声光联合疗法抗肿瘤效应,通过Ce6介导的声光联合疗法对离体培养细胞和在体肿瘤组织的杀伤作用,初步分析了声光联合疗法杀伤肿瘤细胞的机制,以期为SPDT早日应用于肿瘤的临床治疗积累相关资料。