流行性感冒是由流感病毒引起的一种损害呼吸系统为主的疾病,在世界范围内流行,是严重危害人类健康的重要传染病之一。20世纪曾爆发过3次全球性的人间流感大流行,分别由H1N1、H2N2、H3N2亚型流感病毒引起,尤其在1918年爆发的‘西班牙流感’造成2000多万人死亡,严重威胁着人类社会的发展。近年,高致病性H5N1人禽流感时有发生,自1997年香港首次报道人感染H5N1高致病性禽流感病毒以来,已经波及全球很多国家及地区。截止2009年6月2日人禽流感确诊病例433人,死亡262人,死亡率高达60%以上,对人类健康的危害日益严重。因此WHO要求世界各国做好应对流感大流行的防控准备。接种疫苗是防控禽流感的有效手段。目前生产人用高致病性禽流感疫苗的基质主要是鸡胚,然而其存有如下问题:疫苗株的生产周期长,缺乏高质量的鸡胚供应,一旦流感爆发其来源将成为瓶颈,无法及时应对流感疫情。因此,开展人用禽流感疫苗的生产介质研究成为防控高致病性禽流感的重大课题。细胞是生产疫苗的优良介质,目前,获准生产人用流感疫苗的细胞系有两种:Vero细胞和MDCK细胞。其中Vero细胞在全球获得批准使用,MDCK细胞在欧洲获得批准。然而,流感病毒在Vero细胞中存在低复制、低适应性问题,因此,开展Vero细胞高适应性的研究成为亟需解决的课题。流感反向遗传学技术的发展为获得疫苗株提供了强有力的工具,而制备高致病性H5N1人用禽流感疫苗的首要环节就是获得疫苗株。与以往在鸡胚中共感染病毒,再通过筛选获得所需要的重配株相比,使用反向遗传学技术来制备流感疫苗株的方法更直接合理,并大大缩短了产生目的疫苗株的时间,为应对人禽流感病毒的大流行赢得了时间。流感病毒NS基因(非结构基因)包括NS1和NS2两个片段,分别编码NS1蛋白与NS2蛋白。研究显示NS1蛋白对于病毒RNA的翻译及复制起重要作用。而NS2蛋白可与核蛋白相互作用并可介导病毒核糖核蛋白的输出,并且NS2蛋白的核输出信号基序对于减毒活疫苗的生产起至关重要的作用,这说明流感病毒NS基因对于病毒的复制起关键作用。WHO推荐使用Vero细胞来生产人用疫苗产品,而研究发现流感病毒不能在Vero细胞中高滴度复制。为了实现由Vero细胞大规模生产流感疫苗的目的,我们采取两条途径:一方面从流感病毒本身着手,修饰流感NS基因为Vero细胞高适应型,利用反向遗传学方法产生重组疫苗株,使其具有Vero细胞高生长表型;另一方面,对Vero细胞进行改造筛选,获得对禽流感病毒较敏感的细胞株,通过这两条途径为使用Vero细胞大规模生产流感疫苗,快速生产安全有效的疫苗奠定了基础。为将来能够及时预防流感爆发提供了技术保证,因此意义重大。本课题的研究目标是基于Vero细胞利用反向遗传学方法产生能在Vero细胞中高产量增殖的流感疫苗株,即从流感NS基因出发,对其进行基因突变,使其修饰为Vero细胞适应型,HA与NA来自于致弱的H5N1人禽流感疫苗株,剩余基因片段来源于PR8,利用反向遗传学技术采用1+2+5的病毒重组模式产生Vero细胞高适应的人用H5N1流感疫苗株,为Vero细胞生产流感疫苗奠定基础。本研究主要包括以下三部分:1、Vero细胞高产H5N1流感病毒疫苗株的拯救:首先,根据Hoffmann等发表的特异性引物序列通过RT-PCR方法扩增疫苗株重配H5N1-A/Anhui/01/2005的HA、NA基因并测序验证;其次,修饰PR8病毒的NS基因为Vero适应型,分别在NS1基因21、58、60、127、174、189位氨基酸定点突变,并在231-238位缺失,在NS2基因16、31、86、107位氨基酸定点突变,并在231-238位缺失,合成NS基因片段。分别构建质粒pHW2000-HA(A)、pHW2000-NA(A);pHW2000-NS,测序验证正确,分别以7+1模式共转染分别验证其能否正常工作。最后,以构建好的质粒与PR8拯救体系的其它5个内部基因做为骨架,按1+2+5模式共转染Vero细胞拯救H5N1流感病毒疫苗株,并通过检测其基因组序列确定为所需目的病毒株,电镜观察显示符合流感病毒典型形态特征,初步显示病毒拯救成功。2、拯救病毒株的生物学特性的初步鉴定:拯救的病毒株含有疫苗株重配H5N1-A/Anhui/01/2005的HA、NA基因,通过血凝抑制试验鉴定其型别为H5N1亚型;另外,拯救的流感病毒株含有修饰的NS基因,这对其复制特性产生重要影响。在TPCK-胰酶存在的情况下,将等量拯救病毒株与其母本株分别接种于Vero细胞单层,置于37℃、5%CO2孵箱孵育,镜下观察细胞病变(CPE)情况,记录病变时间,初步显示拯救病毒株出现完全CPE的半数时间短于其母本株(18h,25h);此外,对两株疫苗株在Vero细胞中的生长动力学进行检测,结果表明修饰NS基因改善了拯救疫苗株在Vero细胞中的生长特性,显示出其在Vero细胞中的高生长表型。任何疫苗株生物学特征的改善均需保证其抗原性的稳定,我们将疫苗株在Vero细胞中连续传代10次,分别随机检测细胞上清液中病毒的HA、NA、NS基因序列,结果显示同源性均在99.9%以上,说明拯救的疫苗株在Vero细胞传代中没有发生抗原改变,这为疫苗的生产提供了保证。3、拯救的Vero细胞高适应性H5N1疫苗株安全性及免疫原性检测:将拯救的疫苗株在Vero细胞中培养扩增,收获细胞上清液,并经蔗糖密度梯度离心法浓缩纯化病毒。使用鸡胚半数感染剂量(EID50)与半数组织感染剂量(TCID50)测定纯化后的病毒量。SDS-PAGE电泳鉴定拯救的疫苗株含有流感病毒的主要抗原成分。在鸡胚与小鼠模型中对其致病性进行检测,结果显示拯救的疫苗株均不具有致死性,说明其安全。在上述基础上对拯救疫苗株的免疫原性检测,将经蔗糖密度梯度离心法纯化的重配H5N1-A/Anhui/01/2005-NS病毒制成灭活疫苗,以Al(OH)3为佐剂,终浓度为1.6mg/ml。按相同剂量(HA,15μg)肌肉接种8周龄雌性Balb/C小鼠,第一次免疫后14天加强免疫1次,分别在第7、14、21、28天小鼠尾静脉采血检测血清IgG滴度以及HI滴度。结果显示与母本株有相似的免疫原性。结论:本实验利用反向遗传学方法由Vero细胞拯救产生了人用H5N1亚型高致病性禽流感疫苗株——重配H5N1-A/Anhui/01/2005-NS,缩写为rgAnhui/NS。拯救的疫苗株含有修饰的NS基因,并且在Vero细胞中出现细胞病变的时间明显缩短,生长动力学也有改善,这说明拯救的H5N1亚型流感疫苗株具有Vero细胞高适应表型,为应用Vero细胞生产流感疫苗提供了原始数据;另外,拯救的疫苗株含有流行株安徽株的表面抗原基因,型别鉴定为H5N1亚型,符合拯救病毒的预期型别;在Vero细胞中连续传代测定其表面抗原HA、NA的基因序列,未发现改变,表明其抗原保持稳定;分别在鸡胚与小鼠模型中对其致病性进行鉴定,未发现致死性现象,表明拯救的疫苗株安全;小鼠免疫原性检测表明拯救的疫苗株能够诱导有效地免疫反应,并且与母本株相比激发的抗体滴度没有明显差别。这些结果为发展细胞生产流感疫苗提供了保证。