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研究背景及研究目的:Shh信号通路在胚胎发育和成体组织稳态中起关键作用。Shh信号通路的异常激活与几种人类恶性肿瘤的发生密切相关,包括儿童中最常见的恶性脑肿瘤髓母细胞瘤(MB)。目前正在临床试验研究的Shh信号通路抑制剂都是Smo抑制剂(Smoi),如经典的vismodegib。越来越多的研究结果表明,当靶向Smo蛋白进行抑制时,机体的耐药现象迅速出现并产生严重的毒副作用,影响儿童发育。Gli3是调节Shh信号通路的重要转录因子。全长形式的GliFL可以通过蛋白水解加工成抑制形式GliR,其主要作为Shh信号通路的抑制因子发挥作用。然而,Gli3FL蛋白水解加工的过程在MB中受到抑制。本研究尝试从Smo下游寻找药物靶点,特异性针对Gli3 processing,为髓母细胞瘤的靶向药物开发提供新的思路与策略,同时本研究还有助于阐明Gli3 processing的分子机理,加深对Shh信号通路分子调控机制的理解。研究方法:1、采用携带Cre-GFP的慢病毒感染MEF(Ptch1fl/fk)细胞株,通过流式筛选出表达GFP荧光的细胞株,构建MEF(Ptch1-/-)敏感细胞株;采用携带SmoA1-GFP(Smo突变形式)的慢病毒感染MEF WT细胞株,经流式筛选出成功感染病毒的细胞,构建MEF(SmoAl)耐药细胞株。2、采用 MEF(Ptch-/-)、MEF(SmoA1)细胞株,分别给药 vismodegib(Smoi)或转染Gli3R O/E质粒处理,通过蛋白免疫印迹实验和实时荧光定量PCR分析评价处理后细胞株中Shh信号通路的活性变化。3、分子克隆HA-Gli3FL-GFP重组质粒,使表达出的Gli3FL蛋白在N端有HA标签,C端有融合的GFP绿色荧光蛋白。4、在HEK293FT细胞株中转染HA-Gli3FL-GFP重组质粒,实现Gli3FL蛋白的过表达。并利用蛋白免疫印迹技术检测阳性对照药cAMP、FSK处理前后Gli3 processing的变化,同时通过荧光酶标仪检测给药前后体系中GFP荧光强度的变化情况,观察cAMP、FSK促进Gli3 processing的同时,体系中荧光强度是否减弱。5、药物高通量筛选模型:利用HEK293FT细胞株转染HA-Gli3FL-GFP重组质粒,表达24小时后,加待测化合物(10 μM)处理24小时,荧光酶标仪检测体系中的荧光强度。6、利用构建完善的高通量药物筛选平台进行化合物库的高通量筛选。7、筛选出的化合物进一步在MEF(Ptch-/-、MEF(SmoA1)细胞株上通过实时荧光定量PCR检测分析药效。研究结果:1、在MEF(Ptch-/-)敏感株加药vismodegib之后,实时荧光定量PCR能检测到Shh信号通路靶基因(Gli1、Ptch2)转录水平的下降。且随着给药浓度的增加,Gli1、Ptch2转录水平下降明显。然而,在MEF(SmoAl)耐药株加药vismodegib之后,实时荧光定量PCR检测不到Glil转录水平的下降。因此vismodegib对耐药株无效。2、在MEF(Ptch-/-)细胞株中过表达Gli3R之后,蛋白免疫印迹实验和实时荧光定量PCR分别在蛋白和转录水平能检测到Glil的下降。另在MEF(SmoA1)细胞株过表达Gli3R之后,实时荧光定量PCR依然能检测到Shh信号通路靶基因(Gli1、Gli2、Ptch2,Sfrp1)转录水平的下降。因此Gli3R的高表达能逆转Smo突变引起的耐药现象。3、在HEK293FT细胞株过表达Gli3FL蛋白后,加药cAMP,能促进Gli3 processing。随着给药浓度增加,Gli3R表达增多。说明Gli3 processing体外可控。4、靶向Gli3 processing的药物筛选体系的确定:在293FT细胞株中过表达Gli3FL蛋白后,加药cAMP/FSK处理,加药组WB条带灰度Gli3R/Gli3FL比值升高,同时细胞裂解液的荧光强度降低,考虑到药物筛选的成本,本模型采用荧光强度作为筛选指标。5、药物筛选体系的优化:选择最适的转染试剂,细胞株,裂解缓冲液,裂解方法和蛋白表达时间、给药时间,以提高荧光强度、降低复孔间差异。6、利用优化后的高通量药物筛选体系,进行化合物库中1700种化合物的高通量筛选。筛选结果统计显示,有10种化合物的相对荧光强度在0.5左右及以下。7、Top10化合物的药效检测结果显示,化合物10#E3能同时抑制MEF(Ptch-/-)敏感株和MEF(SmoAl)耐药株的Gli1转录水平的表达。蛋白质印迹实验检测表明,化合物10#E3确实增加了 Gli3R/Gli3FL的灰度比。研究结论:本研究证实通过促进Gli3 processing可以抑制MEF(Ptch-/-)敏感株以及MEF(SmoA1)耐药株中的Shh信号通路,然而Smo抑制剂vismodegib对耐药株无效。展示了以Gli3 processing为靶点对于耐药肿瘤治疗的优越性。进一步研究证明Gli3 processing体外可控。基于此,我们建立了一个靶向Gli3 processing的高通量药物筛选体系:HEK293FT细胞株转染HA-Gli3FL-GFP重组质粒,待测化合物处理24小时后,酶标仪检测荧光强度,若荧光强度降低则表明化合物促进了 Gli3 processing。基于此模型,最终筛选出化合物10#E3对敏感株和耐药株均有抑制Shh信号通路的效果,有望用于敏感型和耐药型髓母细胞瘤的治疗。