粘质沙雷氏菌脂肪酶可以立体选择性水解拆分消旋体反式3-(4’-甲氧苯基)缩水甘油酸甲酯(MPGM)制各地尔硫卓的中间体(2R,3S)-(-)-3-(4’-甲氧苯基)缩水甘油酸甲酯，即(-)-MPGM。本文利用本实验室筛选得到的粘质沙雷氏菌(Seratiamarcescens)ECU1010，研究了脂肪酶的发酵和固定化，基因克隆及表达优化，并利用重组的脂肪酶对酮洛芬酯进行了拆分研究。 在摇瓶中对S.marcescensECU1010的脂肪酶发酵进行了优化，研究了诱导剂、碳源以及氮源对发酵的影响。发现吐温是最佳的诱导剂，糊精和牛肉膏分别是最佳的碳源和氮源，确定了粘质沙雷氏菌ECU1010脂肪酶发酵的培养基组成。经过培养基优化，摇瓶发酵的脂肪酶酶活力达到了10000U/l。研究了装液量和摇床转速对发酵的影响，发现在摇瓶中溶氧的供应是粘质沙雷氏菌ECU1010脂肪酶发酵的限制性因素之一。 在5L及30L发酵罐中进行粘质沙雷氏菌ECU1010脂肪酶发酵的放大，同时考察了溶氧、通气速率及诱导剂流加时间等因素对菌体生长和产酶的影响。证实溶氧的供应是粘质沙雷氏菌ECU1010脂肪酶发酵的限制性因素之一，在5L发酵罐中通过控制最低溶氧≥20﹪以及增加通气速率，使吐温的用量降低到了2g/l而脂肪酶酶活仍然达到了10000U/l。 利用PCR方法克隆了粘质沙雷氏菌ECU1010的胞外脂肪酶基因，该基因全长1845bp，编码614个氨基酸，与基因数据库中其它的粘质沙雷氏菌脂肪酶基因在DNA水平有94～96﹪的同源性，在氨基酸水平有96～98﹪的同源性。利用大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌株、pET-24a(+)作为表达载体，对粘质沙雷氏菌的脂肪酶基因进行了表达。测序结果证明，所表达的基因序列与克隆的脂肪酶基因完全一致。 在摇瓶中对重组菌进行了脂肪酶的发酵优化。考察了诱导剂浓度、葡萄糖、Ca2+以及温度等对重组酶可溶性表达的影响，发现Ca2+是限制重组菌产酶的重要因素之一，适量的葡萄糖和可以有效地促进重组酶地可溶性表达，通过低温(20℃)诱导显著地提高了脂肪酶的产量。经过优化脂肪酶产量达到了5000～6000U/l。 对来源于野生菌S.marcescensECU1010，DH5α/pBCLipC1和BL21(DE3)/pBCLipE1的脂肪酶的性质进行了比较研究。考察了这三种酶的温度稳定性和最适反应温度，pH稳定性和最适反应pH。发现来源于S.marcescensECU1010和DH5α/pBCLipC1的脂肪酶性质比较接近，而来源于BL21(DE3)/pBCLipE1的脂肪酶对温度的敏感性增加了，温度的升高可以使酶活力提高2倍多，pH稳定性和最适反应pH也与野生酶不同。当进行冻干提取和丙酮沉淀时，表达的重组酶的酶活力回收率远高于野生脂肪酶。表明表达的重组酶的性质发生了改变，可能是由于脂肪酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达环境和在S.marcescensECU1010中的表达环境不同造成了酶分子发生了不一样的折叠，导致了酶性质的改变。 通过对不同载体固定化沙雷氏菌脂肪酶的效果进行比较，发现硅藻土和环氧树脂EupergitC是比较好的固定化载体。考察了游离酶和两种固定化酶的热稳定性、pH稳定性及储存稳定性，并对两种固定化酶的操作稳定性进行了比较。EupergitC固定化酶的操作稳定性好，而硅藻土固定化酶则价廉易得。利用交联的硅藻土固定化酶在500ml搅拌式反应器中对(±)-MPGM进行了拆分5批次反应，制备获得光学纯的(-)-MPGM18.6克，收率为37.2﹪。 比较了粘质沙雷氏菌脂肪酶及其重组酶对手性消炎药物酮基布洛芬的甲酯、乙酯、丁酯和辛酯等6种酮洛芬酯的拆分效果，发现这两种酶可以高立体选择性拆分酮洛芬乙酯生成(S)-酮洛芬，当转化率≥45﹪时，eep＞90﹪。考察了Brij92V，TritonX45和Tween-80等8种表面活性剂对沙雷氏菌脂肪酶及其重组酶活性的影响。发现8种表面活性剂都对野生脂肪酶有强烈的抑制作用，其中6种对重组酶的酶活有抑制作用，而Brij92V和SynperonicPE/L61则对重组酶有激活作用。随后考察了这8种表面活性剂对重组酶拆分拆分酮洛芬乙酯的影响，发现Brij92V可以显著提高该酶的选择性，当转化率为42.6﹪时，eep=99.6﹪，E＞1000。对Brij92V做乳化剂拆分酮洛芬乙酯的反应体系进行了研究，发现底物对反应没有抑制作用而产物(S)-酮洛芬则对反应有一定的抑制作用。当底物浓度一定时，增加Brij92V的浓度可以提高酶的选择性；在高底物浓度100mM和高转化率(＞40﹪)时，要获得＞99﹪ee以上光学纯度的产物则必须将Brij92V的浓度提高到5﹪。