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研究背景和目的:肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,具有早期症状不明显、发病率高以及预后差等特点,而慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是HCC发生的最常见的危险因素。HCC的诊断主要依赖于影像学检查、活检以及血清学标志物甲胎蛋白(alpha feto-protein,AFP)的水平。但是目前HCC发生的风险人群数量庞大,基于当前中国的经济水平还很难普及常规的影像学检查,而作为金标准的肝组织活检是一个有创操作,取样准确与否和并发症发生风险取决于医生的操作水平,并且不能用于显著肝硬化患者。血清学标志物诊断HCC快速简便而且成本低廉,然而AFP诊断效能不太满意,蛋白芯片技术为发现新的诊断HCC的血清学标志物提供了便利。Wnt信号通路与细胞的增殖、分化、迁移、胚胎发育以及肿瘤发生密切相关,在多数肿瘤中均可发现Wnt信号通路的激活。Wnt通路分为经典的Wnt通路和非经典的Wnt通路。磷脂酰肌醇蛋白3(glypican-3,GPC-3)是硫酸肝素蛋白聚糖家族成员之一,该蛋白能与经典和非经典的Wnt通路作用而上调该信号通路的表达。许多研究评估了GPC-3诊断HCC的价值,但是各研究之间结论并不一致。分泌卷曲相关蛋白4(secreted frizzled related protein 4,s FRP-4)属于分泌卷曲相关蛋白家族,该蛋白结构上存在一个潜在的Wnt结合位点,因此也被认为是Wnt通路的调控因子。研究发现s FRP-4能够抑制Wnt信号通路,而且在许多肿瘤中s FRP-4启动子区域存在高度甲基化。本研究首先将从循证医学角度探讨GPC-3在HCC中的诊断价值,并利用芯片筛选出候选的血清学标志物,然后在两个独立的临床人群中进行评估。方法:第一部分:从循证医学角度评估GPC-3诊断HCC的价值我们做的是诊断准确性的meta分析。纳入的研究的标准为同时测量了研究对象为HCC的血清AFP和GPC-3水平的临床研究;文献检索的范围为EMBASE、Pubmed、Cochrane图书馆以及中国相关文献数据库等。入组的研究所提取的数据主要有研究的第一作者、国家、发表时间、病例基线情况、标志物的检测方法、截断值以及具体诊断数据等。纳入研究质量的研究根据的是Cochrane推荐的QUADAS量表,异质性探讨主要从阈值效应和非阈值效应两方面进行。第二部分:蛋白质芯片对血清学标志物的初筛初筛的16例患者来自于2013年到2014年之间在西南医院感染科门诊就诊的病例,其中HCC患者8例,慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者4例,慢性乙型肝炎肝硬化患者4例。通过包含507个因子的蛋白质芯片对16例患者进行筛查,对得到的数据进行分析并获得差异表达的因子。第三部分:候选因子的临床检测与验证我们分别纳入了所有2013年3月至2014年2月以及2014年3月至2014年10月在西南医院感染科就诊且之前未接受抗肿瘤治疗的HCC病例以及部分对照,按照时间划分为两个独立人群(测试组和验证组),使用第二部分得到的差异表达的因子的ELISA试剂盒在测试组中检测,并于验证组中验证在测试组中具有诊断价值的候选标志物,并与AFP诊断HCC的价值最对比。第四部分:候选标志物在肝癌/癌旁组织的免疫组化使用包含30例HCC患者(每位患者均取癌及癌旁组织两个点)的组织芯片,使用免疫组化检测候选标志物在癌/癌旁组织的表达,并进行分析。结果:第一部分:GPC-3诊断HCC的循证医学研究一共从543条文献记录中筛选并入组10篇研究,使用的是随机效应模型。在10个研究中,GPC-3的合并敏感性和特异性分别为59.2%(95%CI:55.1%-63.1%)和84.8%(95%CI:82.0%-87.3%),DOR为17.988(95%CI:5.361-60.353);AFP的合并敏感性和特异性分别为51.9%(95%CI:47.7%-56.0%)和94.0%(95%CI:92.1%-95.6%),DOR为23.4(95%CI:10.291-53.207);在7个研究中,GPC-3联合AFP的合并敏感性和特异性分别为77.3%(95%CI:73.2%-81%)和80.9%(95%CI:77.4%-84%),DOR为21.255(95%CI:8.699-51.932)。第二部分:候选标志物的芯片初筛在507个因子中,首先筛出了1个HCC中低表达的因子CCR-7和两个HCC中高表达的因子FGF-23和NT-3,经过分析剔除一个病例之后,又增加了9个在HCC中高表达的因子:s FRP-4、MIP-3 beta、IL-31 RA、PTX-3、insulysin/IDE、S100A10、MMP-2、P-selectin、IL-2 R alpha和RANK/TNFRSF11A。第三部分:候选标志物的临床检测与验证本研究共检测了CCR-7、FGF-23、NT-3和s FRP-4四个因子。在测试组中,仅有s FRP-4在HCC与非HCC之间存在显著性差异(P<0.001)。在验证组中s FRP-4同样表现出显著性差异(P<0.001)。测试组中s FRP-4和AFP的ROC曲线下面积(area under ROC,AUC)分别为0.847(95%CI:0.788-0.906)和0.857(95%CI:0.788-0.906),联合诊断AUC为0.941(95%CI:0.908-0.975)。s FRP-4的敏感性和特异性分别为94%和60.5%(cut-off:46.37ng/m L),AFP的敏感性和特异性分别为75%和84.9%(cut-off:11.3ng/m L),联合诊断的敏感性和特异性分别为79.2%和95.3%。验证组中s FRP-4和AFP的AUC分别为0.891(95%CI:0.839,0.942)和0.850(95%CI:0.781-0.919),联合诊断的AUC为0.932(95%CI:0.890-0.975)。s FRP-4的敏感性和特异性分别为78.6%和84.4%(cut-off:61.39ng/m L),AFP的敏感性和特异性分别为71.4%和97.4%(cut-off:13.5ng/m L),联合诊断的敏感性和特异性分别为88.6%和89.6%。s FRP-4水平与AFP水平、血糖水平均不相关(P>0.05)。第四部分:候选标志物的免疫组化芯片30例60份样本中,阳性57份,阴性3份,阴性标本均为癌组织。所有患者s FRP-4在癌旁组织的染色均强于癌组织,且s FRP-4的染色有随着癌细胞分化程度降低而变淡的趋势。结论:本课题探讨了GPC-3与s FRP-4诊断HBV相关HCC的临床价值:一、GPC-3诊断HCC的价值与AFP相当,GPC-3与AFP联合可提高诊断敏感性。二、s FRP-4在HCC人群中表达高于非HCC人群,其诊断HCC的价值与AFP类似,s FRP-4与AFP联合可提高HCC诊断效率。三、s FRP-4在癌组织中的表达低于癌旁组织,且表达水平与分化程度有正相关的趋势。