目的： 本研究对一系列吡唑啉酮衍生物(Lgf-YL)在四种人类肿瘤细胞HepG2、OVCAR3、KB及KBv200进行体外筛选，发现一种吡唑啉酮水杨酰肼席夫碱类化合物(Lgf-YL-9)的细胞毒活性最为显著，从而进一步就Lgf-YL-9对人口底癌KB细胞及其MDR KBv200细胞的体内外抗增殖活性及分子机制进行研究。 方法： 采用MTT法对13种吡唑啉酮衍生物进行细胞毒测定及体外筛选；裸鼠移植瘤实验研究Lgf-YL-9对KB及KBv200细胞裸鼠移植瘤的抗增殖作用；光镜及荧光显微镜下观察凋亡细胞形态；DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA ladder及药物与DNA反应测定；Annexin V-PI双染法分析细胞凋亡率；流式细胞仪检测△ψ m及细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的变化；Western Blot研究细胞凋亡途径及分子机制。 结果： 1、吡唑啉酮衍生物的抗增殖作用。吡唑啉酮衍生物对HepG2、OVCAR3、KB及KBv200细胞的体外筛选Lgf-YL-2、-5、-13对四种肿瘤细胞无细胞毒活性(IC<,50>>100μg/ml)。Lgf-YL-7、-12对HepG2和KBv200细胞有微弱的细胞毒活性。Lgf-YL-1、-3对HepG2细胞以及Lgf-YL-6、-8对KB细胞无细胞毒活性(IC<,50>>100μg/mL)，对其他三种细胞的细胞毒活性较弱。Lgf-YL-4、-11对四种细胞展现了中等程度的细胞毒活性。值得注意的是Lgf-YL-9、-10对四种肿瘤细胞显示了显著的细胞毒活性，尤其是Lgf-YL-9的细胞毒活性最强，而且Lgf-YL-9对KBv200细胞的细胞毒活性是Lgf-YL-10的八倍，以上结果表明Lgf-YL-9作为一种新型的抗癌物质值得被进一步研究。 Lgf-YL-9在体内外对KB和KBv200细胞的抗增殖作用体外MTT测定结果Lgf-YL-9对KB和KBv200细胞的IC<,50>值分别为3.81±0.02μg/ml和3.45±0.03μg/ml，两者在统计学上差异无显著性。体内抑瘤实验结果显示给药浓度为1.5、3、6 mg/kg的Lgf-YL-9对KB及KBv200细胞移植瘤的抑瘤率分别为22.98﹪、34.68﹪、43.15﹪及25.37﹪、38.43﹪、47.50﹪。 2、Lgf-YL-9诱导细胞凋亡的作用本研究采用多种实验方法检测Lgf-YL-9诱导细胞凋亡的作用。光镜下观察到Lgf-YL-9对四种肿瘤细胞的损伤呈浓度依赖性增大。12μg/mL的Lgf-YL-9作用于KB及KBv200细胞24小时后，Hoechst 33258染色在荧光显微镜下可见对照组细胞呈均匀弥散蓝色荧光，凋亡细胞呈浓染致密的颗粒状荧光，并有典型的凋亡小体形成。采用DNA琼脂糖凝胶电泳实验证实Lgf-YL-9能诱导KB和KBv200细胞的DNA出现凋亡相关的DNA ladder改变并呈现时间和浓度依赖性递增。Annexin V-PI双染测定Lgf-YL-9对KB及KBv200细胞的凋亡率，结果显示Lgf-YL-9对这两种肿瘤细胞的凋亡作用相近。 3、Lgf-YL-9诱导细胞凋亡的机制探讨。 Lgf-YL-9诱导的细胞凋亡可能不是通过与DNA发生嵌合作用为探讨Lgf-YL-9诱导的细胞凋亡是否与LgfoyL-9和DNA发生嵌合反应有关，采用药物与DNA反应测定实验，结果证实在Lgf-YL-9与DNA的反应体系中，不同浓度的Lgf-YL-9分别作用于KB和KBv200细胞不同时间后，DNA荧光强度与对照相比无改变。在表阿霉素(Epirubicin，EDR)作用下，DNA荧光强度与对照相比呈浓度和时间依赖性降低。结果提示EDR能够与KB和KBv200细胞的DNA发生嵌合反应，而Lgf-YL-9可能不与KB和KBv200细胞的DNA发生嵌合反应。 Lgf-YL-9可能不是通过死亡受体途径诱导细胞凋亡为探讨Lgf-YL-9诱导的细胞凋亡是否与死亡受体途径有关，采用WestemBlot方法检测死亡受体途径的启动Caspase即Caspase-8，结果在KB及KBv200细胞均未检测到Caspase-8的激活裂解带。 Lgf-YL-9是通过非依赖ROS升高的线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡Lgf-YL-9诱导的凋亡是否与线粒体凋亡途径有关呢?采用DiOC<,6>(3)荧光染料对△ψm进行检测，结果显示不同浓度的Lgf-YL-9分别作用KB和KBv200细胞24小时后，两种细胞的△ψm均呈浓度依赖性下降。Western Blot进一步测定细胞内Cyto-C含量及Caspase-9、-3、-7及多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)，结果显示不同浓度Lgf-YL-9作用KB和KBv200细胞24小时后，胞浆Cyto-C均呈浓度依赖性聚集并诱导了凋亡相关蛋白的激活。采用DCFH-DA荧光染料对细胞内ROS进行检测，结果显示12μg/ml的Lgf-YL-9作用KB和KBv200细胞24小时后，两种细胞内的ROS与对照组相比呈显著性下降。 Lgf-YL-9可以调节Bcl-2家族主要蛋白的表达Bcl-2家族成员与线粒体凋亡途径关系密切，我们采用Westem Blot方法检测Bcl-2家族中几个重要的成员：Bcl-2、Bcl-xL、Bax及Bad。不同浓度的Lgf-YL-9分别作用于KB和KBv200细胞24小时后，结果显示Lgf-YL-9可以下调Bcl-2及Bcl-XL的表达，同时上调了Bad的表达，但对Bax的表达无影响。 3.3.5 Lgf-YL-9可能不作用于AKT及ERK-MAPK信号转导通路为探讨Lgf-YL-9是否作用于细胞生长信号通路AKT及ERK-MAPK，不同浓度的Lgf-YL-9分别作用于KB和KBv200细胞24小时后，采用Western Blot方法检测p-AKT、AKT及p-ERK1/2、ERK1/2的表达。结果证实在总的AKT及ERK1/2表达无变化的情况下，Lgf-YL-9没有下调p-AKT及p-ERK1/2的表达。 4、Lgf-YL-9没有下调KBv200细胞P-gp的表达为探讨MDR KBv200细胞对Lgf-YL-9不具有凋亡抗性的原因，采用WesternBlot方法检测P-gp的表达，不同浓度的Lgf-YL-9分别作用于KB和KBv200细胞24小时后，结果显示敏感株KB细胞中没有P-gP的表达，Lgf-YL-9没有改变MDR KBv200细胞中P-gP的表达。 结论： 1) 13种吡唑啉酮衍生物在四种人类肿瘤细胞体外筛选的结果证实Lgf-YL-9的细胞毒活性最为显著。 2) 体内外抗增殖实验证实Lgf-YL-9对KB及MDR KBv200细胞具有相近的抗增殖活性。 3) Lgf-YL-9能够诱导KB及MDR KBv200细胞凋亡。 4) Lgf-YL-9诱导的细胞凋亡途径可能不是通过死亡受体途径，而是通过非依赖ROS升高的线粒体途径。 5) Lgf-YL-9能够调节Bcl-2家族主要蛋白的表达；初步认为Lgf-YL-9不与DNA发生嵌合反应，也不作用于AKT及ERK-MAPK信号转导通路。 6) Lgf-YL-9作为一种新型的抗癌物质可能不是P-gp的底物。