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第一部分Crx在肺腺癌中的表达变化及其临床意义分析目的:肺腺癌(Lung adenocarcinoma,LUAD)的发病分子机制仍不明确,解析肺腺癌发生发展分子机制,寻找新的分子治疗靶点十分重要。锥杆同源框基因(cone-rod homeobox,Crx)作为一种致癌转录因子促进髓母细胞瘤的发生发展,其表达与肺腺癌预后相关,但生物学功能和分子作用机制仍不十分清楚。因此,本研究检测Crx在肺腺癌组织及细胞中的表达,分析其临床意义。方法:收集2018年8月~2020年1月间在河北医科大学第四医院胸外科行手术切除的20例LUAD组织与癌旁正常肺组织样本,本院病理科证实样本病理类型,纳入标准包括患者为初次手术治疗,术前未进行放化疗和其他类型的抗癌治疗。LUAD与相邻的非肿瘤组织标本一部分用于石蜡包埋,另一部分用于液氮快速冷冻提取总RNA或蛋白。所有样本保存于河北医科大学第四医院科研中心,且河北医科大学第四医院伦理委员会批准该项研究内容。采用Real-time PCR和免疫组织化学法分别检测LUAD组织和癌旁肺组织中Crx m RNA和蛋白表达水平;生物信息学分析Crx表达与LUAD预后的关系;Western blot法检测体外培养的不同肺癌细胞系中Crx的表达;相关性分析LUAD组织中Crx表达与患者临床病理参数(性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小、淋巴结转移、分期)之间关系。结果:1.与癌旁正常组织比较,LUAD组织Crx m RNA表达水平明显升高(P<0.05);免疫组化结果显示,LUAD组织Crx蛋白表达升高。2.Western blot法检测结果显示,在5个肺癌细胞株中,H1299细胞Crx蛋白表达水平最高。3.LUAD组织Crx m RNA表达水平与患者临床参数之间比较发现,LUAD患者Crx表达水平与肿瘤大小和淋巴结转移相关(P<0.05),与患者年龄、性别、吸烟史及肿瘤分期无明显相关性。第二部分Crx表达对肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响目的:应用小干扰RNA(siRNA)和表达质粒(pc DNA3.0)转染技术,在H1299细胞中特异性敲低或过表达Crx,探讨转录因子Crx表达对肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响,为以Crx靶点的LUAD治疗提供实验依据。方法:设计并合成靶向沉默人Crx的siRNA(siRNA-Crx)和非特异性对照siRNA(si-Con)以及重组表达质粒(pc DNA3.0-Crx)和空载体质粒(pc DNA3.0)为对照分别转染H1299细胞,采用Western blot方法检测Crx敲低或过表达的转染效率;对不同转染并经处理后的肿瘤细胞进行CCK-8、划痕实验和Transwell侵袭实验,观察抑制或过表达Crx后H1299细胞的肿瘤生物学功能变化。结果:1.Western blot法分析结果显示,与si-Con组比较,转染siRNA-Crx能够有效干扰Crx在H1299细胞中的表达,干扰效率超75%(P<0.05);与pc DNA3.0组比较,转染pc DNA3.0-Crx能够显著增加Crx在H1299细胞中的表达,过表达效率超65%(P<0.05)。2.CCK-8实验结果显示,与si-Con组比较,转染siRNA-Crx 48 h后能够有效抑制H1299细胞的增殖活性(P<0.05);相反,与pc DNA3.0组比较,转染pc DNA3.0-Crx能够显著增强H1299细胞的增殖活性(P<0.05)。3.划痕实验结果显示,与si-Con组比较,转染siRNA-Crx后能够有效抑制H1299细胞的迁移能力(P<0.05);相反,与pc DNA3.0组比较,转染pc DNA3.0-Crx能够显著增强H1299细胞的迁移能力(P<0.05)。4.Transwell侵袭实验结果显示,与si-Con组比较,转染siRNA-Crx后能够有效抑制H1299细胞的侵袭能力(P<0.05);相反,与pc DNA3.0组比较,转染pc DNA3.0-Crx能够显著增强H1299细胞的侵袭能力(P<0.05)。第三部分Crx调控肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭功能的分子作用机制研究目的:探讨肺腺癌细胞H1299中Crx转录调控circRNA_0072088表达,circRNA_0072088通过海绵吸附抑制miR-1261表达和促进PIK3CA表达发挥对H1299细胞增殖、迁移和侵袭功能影响的分子机制。方法:生信分析预测circ_0072088与miR-1261、miR-1261与PIK3CA以及Crx与circRNA_0072088的亲本基因ZFR启动子区的潜在结合位点;在线分析Crx、PIK3CA表达与LUAD的预后关系;H1299细胞敲低或过表达Crx,用q PCR法检测circRNA_0072088的表达变化,及其在LUAD和癌旁对照组织中的表达;RNase R实验验证其在肺癌细胞中的特异性表达;Sanger测序鉴定circ_0072088的环化剪接点序列;FISH实验验证circ_0072088在细胞和组织中的表达和定位;免疫组化染色检测PIK3CA基因的蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验验证Crx与circRNA_0072088的亲本基因ZFR启动子、circRNA_0072088与miR-1261以及miR-1261与PIK3CA的3’UTR的相互作用;采用RIP实验验证circ_0072088与miR1261的相互作用;q RT-PCR和Western blot实验检测敲低circ_0072088、miR-1261以及PIK3CA的表达;采用CCK-8、划痕愈合和Transwell实验证实circ_0072088及其下游分子miR-1261和PIK3CA表达变化对肺腺癌H1299细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:1.数据库预测结果显示,Crx与circ_0072088亲本基因ZFR启动子区存在潜在结合位点;Targetscan数据库预测结果显示,circ_0072088序列中miR-1261结合位点打分值最高,以及miR-1261与PIK3CA的m RNA3’UTR存在结合可能。2.q RT-PCR和FISH实验结果表明,过表达和敲低Crx与circ_0072088的相对表达升高和降低结果趋势一致,circ_0072088和miR-1261共定位于细胞质中;miR-1261在LUAD组织中表达显著低于对照组(P<0.05)。3.RIP实验、Ch IP-PCR实验结合荧光素酶报告基因分析结果显示,Crx与ZFR启动子、circ_0072088与miR-1261以及miR-1261和PIK3CA m RNA 3’UTR存在直接相互作用关系。4.qRT-PCR和免疫组化分析结果显示,PIK3CA在LUAD组织中表达显著高于癌旁对照组(P<0.05);且Crx和PIK3CA高表达与LUAD患者预后差相关(P<0.05)。5.CCK-8、划痕和Transwell实验分析结果证实,circ_0072088的表达升高与降低分别促进或抑制H1299细胞的增殖、迁移和侵袭;生物学功能富集分析结果显示,细胞迁移功能变化与miR-1261表达相关。结论:1.Crx在LUAD组织中表达上调,且与肿瘤的大小、转移相关;2.Crx激活circ_0072088的转录表达,促进肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭功能;3.Circ_0072088-miR-1261-PIK3CA调节通路介导Crx表达,促进肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭功能;沉默Crx基因或抑制circ_0072088-miR-1261-PIK3CA信号轴有望应用于LUAD的靶向治疗。