终末期肝病是威胁我国人民生命健康的一大类疾病,目前临床上治疗它的最有效的办法是原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT),但因其供体极度短缺极大地限制了这一治疗手段的广泛开展。对于这一问题,肝脏组织工程构建无异于是一个好的解决办法。众所周知,肝脏中的实质细胞除了占绝对主体的肝细胞外,还存在着胆管上皮细胞(biliary epithelial cells,BECs),虽然BECs仅占肝脏细胞总数的3%～5%,但其有着重要的功能,比如:分泌胆汁、调节胆汁的组成、控制胆汁流量和运输胆汁。BECs的这些功能可以很好地维持肝脏功能的完整性。因此,在肝脏的组织工程学研究中,要想得到结构功能兼备的肝单元结构,同肝细胞一样,BECs也是必不可少的。然而,目前肝脏组织工程的研究方向主要集中在向肝细胞的诱导分化上,对于BECs的研究甚少。具有高度自我更新和发育全能性的胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)在适宜的环境中可以向各种组织细胞分化,有望为肝脏的组织工程提供理想的种子细胞。本研究主要分为两大部分,在第一部分中,我们首先建立了CK19启动子调控的双报告载体,经慢病毒转染肝干/祖细胞(hepatic progenitor cells,HPCs)系,建立了稳定表达的细胞系,之后利用体外共培养的方法诱导HPCs分化为BECs,验证了报告载体的功能;在第二部分中,我们在体外培养了小鼠ES细胞,并且建立了稳定表达报告载体的小鼠ES细胞系。这一研究不仅提供了纯化目的细胞的手段,同时也为以细胞治疗和基因治疗为基础的肝脏再生医学的基础研究提供了一些方法。本研究主要包括以下两部分内容。一、CK19启动子调控的双报告载体的构建近年来,遗传修饰技术的逐步成熟为细胞分化研究提供了便利的工具。遗传修饰技术可以方便地“跟踪”目标细胞分化的情况,从而能够使原本不易察觉的分化过程变得易于研究。在本研究中我们首先构建了由BECs较为特异的标志CK19启动子调控的双报告载体pCK19-Rluc-mRFP,然后通过遗传修饰技术建立了稳定转染表达载体pCK19-Rluc-mRFP的HPCs。接下来,我们利用EPM-PT67细胞与HPCs稳定株共培养的方法诱导后者分化为BECs,之后通过细胞形态的变化、RT-PCR和Western-blot等结果说明HPCs被诱导到了BECs,同时海肾荧光素酶和红色荧光蛋白的表达情况说明我们构建的报告载体pCK19-Rluc-mRFP在细胞分化过程中能够发挥指示和报告作用。(一)在肝脏中CK19是BECs的特异性基因肝系细胞在发育分化过程中缺乏一致的特异性标志物,只有一些高度表达的标志物,这些标志为我们识别成功诱导分化的细胞奠定了一定的基础,其中特异性标记的筛选在分化细胞的鉴定中具有更重要的意义。细胞角蛋白(cytokeratins,CKs)是一种分化特异的蛋白质,属于中间纤维家族,与细胞分化和细胞骨架的组织有关。CKs广泛存在于上皮类细胞中,是其重要的标志。CKs在很多组织(如:肝脏、胰腺、膀胱等)的上皮细胞中都有表达,其中CK19呈高表达状态,但是在肝脏中CK19是BECs的特异性标志基因[1,2]。Michael Lie-A-Ling等为了更早期更准确地诊断胆管癌,在BECs的多种标志物中筛选出了CK19,并构建了由人CK19启动子启动萤火虫荧光素酶的质粒pShuttle-CK19-Luc,然后将其转入人胆管癌细胞中以测定其表达效率,在候选的启动子中CK19启动子比其它更高效地表达。这样通过测定各种标志物的表达效率,Michael Lie-A-Ling等认为CK19是BECs的较为特异性基因[3]。(二)表达载体pCK19-Rluc-mRFP的构建CK19在BECs中高表达,是识别BECs的一个较为特异的细胞标志。在本实验中,我们首先从HepG2细胞的全基因组、pcDNA3.1-hrl-mrfp-ttk载体[4]和pcDNA3.1质粒中用高保真DNA聚合酶分别扩增出CK19核心启动子、Rluc-mRFP序列和poly A序列三个目的片段,然后通过相应地酶切位点将三个目的片段插入慢病毒干涉载体pSicoR-GFP,这样就构建成了一个由CK19启动子调控Rluc-mRFP的表达载体pCK19-Rluc-mRFP。四酶切鉴定显示出载体中含有744bp、1650bp和225bp大小的三个插入片段,测序鉴定也证明了载体中插入片段的正确性。另外,该载体中还含有一段可以编码绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的基因,可将此作为获得稳定转染pCK19-Rluc-mRFP表达载体的细胞株的标记。(三)通过共培养诱导WB细胞分化为BECs对表达载体进行功能验证WB-F344(简称WB)细胞是从正常成年雄性Fisher大鼠肝脏中分离出的一类HPCs [5,6],非致癌性,在表型上具有HPCs的特征[7,8]。我们引入WB细胞是因为它在体内可以分化为肝细胞[9]和BECs[10],在体外也是研究向肝细胞[11]和BECs[12]分化的一个良好的HPCs模型,故可以作为验证构建的表达载体功能方面的模型细胞。我们通过慢病毒感染将表达载体pCK19-Rluc-mRFP整合入WB细胞的基因组中,得到了稳定转染pCK19-Rluc-mRFP基因片段的WB细胞株。接下来,我们利用EPM-PT67细胞(系我实验室利用脂质体转染法将EPM质粒转染进PT67细胞中并通过极限稀释法筛选出稳定表达EPM的PT67细胞)与稳定转染表达载体pCK19-Rluc-mRFP的WB细胞共培养的方法诱导后者分化为BECs(此诱导BECs分化的方法系由我实验室姚海雷博士和贾雅丽博士共同创建)。我们发现不仅WB细胞形态发生了变化排列为二维环状结构,而且RT-PCR和Western-blot的结果也证明共培养方法使WB细胞分化为了BECs。从与对照组比较的结果可知观测到的红色荧光和海肾荧光确实是由其上游的CK19启动子启动后表达的,而且经定量检测发现实验组比对照组的海肾荧光素酶的表达量增加了13.6倍。综合这些实验结果我们可以知道构建的表达载体pCK19-Rluc-mRFP不仅在结构上完全正确而且能够方便地反映出HPCs向上皮样细胞分化的情况。同时,这一载体的构建也为HPCs和ES细胞向BECs分化机制的研究提供了便捷的工具。二、稳定表达pCK19-Rluc-mRFP载体的小鼠ES细胞系的建立ES细胞是胚胎细胞或原始生殖细胞经体外分化抑制培养而筛选出的细胞,它具有发育上的全能性。它在发育阶段上类似于早期胚胎的内细胞团细胞,具有与早期胚胎相似的分化潜能,此外它还兼有胚胎细胞和体细胞的相似的特征,既可进行体外培养、扩增,又可分化为三个胚层的各种组织[13-19]。ES细胞被广泛应用于组织工程、动物克隆、哺乳动物基因的表达与调控研究以及发育生物学研究等领域,并有望为心肌坏死、帕金森疾病、糖尿病、肝功能衰竭、Duchenne’s肌营养不良等疾病提供根治的手段[20-22]。1981年Evans建立了第一个小鼠ES细胞系[23],此后以此细胞系为模型已经成功地诱导出三个胚层的20多种细胞类型。为维持小鼠ES细胞的干性,我们将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)上,建立了标准的小鼠ES细胞体外培养体系。在前面的研究中,我们从结构和功能上同时证明了所构建的表达载体pCK19-Rluc-mRFP的正确性和实效性。接下来,我们通过慢病毒感染将表达载体pCK19-Rluc-mRFP转入小鼠ES细胞,然后通过流式细胞术分选出表达GFP的小鼠ES细胞。经过体外多次传代培养,小鼠ES细胞稳定表达GFP,并且还能在体外分化为拟胚体( embryoid body , EB )。证明我们得到了稳定转染pCK19-Rluc-mRFP基因片段的小鼠ES细胞,这一结果的应用可能为日后纯化ES细胞和ES细胞来源的上皮类细胞提供新的方法。综上所述,我们通过构建CK19启动子调控的RFP报告系统可以实时地研究HPCs在不同诱导条件下的分化去向,同时通过CK19启动子调控的海肾荧光素酶报告系统可以定量地检测CK19启动子活性的变化情况,这一工作将有利于我们进一步开展HPCs向BECs发育成熟过程中调控机制的研究。除此之外,具有发育全能性的ES细胞也将为肝脏组织工程、HPCs移植和以HPCs为载体的基因治疗等提供优良的种子细胞,借助核移植技术和现有的ES细胞库等资源有望在肝脏疾病的治疗中发挥更大的作用,而现代生物科学及其相关技术在该领域中的应用势必将加快其在临床移植修复治疗中的应用进程。