目的本研究旨在筛选和鉴定肺癌A549细胞中自噬相关蛋白组,通过这些蛋白的已知肿瘤生物学功能或研究其未知的肿瘤生物学功能,以确定细胞自噬在肺癌发生发展中的作用。方法1、构建LC3家族6个成员的GST融合蛋白克隆:GST-LC3A、GST-LC3B、GST-LC3C、GST-GABARAP、GST-GABARAPL1、GST-GABARAPL2。2、通过GST-沉淀实验分离出人肺癌细胞A549裂解液中能与LC3家族6个GST融合蛋白特异性结合的条带,将条带切下进行蛋白质谱分析。3、对质谱鉴定出来的候选蛋白整理统计并按照氨基酸序列中是否具有LIR基序核心共识别序列W-X1-X2-（L/I/V）（W,色氨酸;X,任意氨基酸;L,亮氨酸;V,缬氨酸;I,异亮氨酸。）及其生物学功能等条件进行筛选、分类和分析;将具有代表性的潜在自噬蛋白的c DNA克隆至表达载体中,通过GST-LC3融合蛋白沉淀实验进行验证。4、对NCOA7、MAP4K2、PELP1、WDR6、MIA3、RABGAP1、BCAR3、AFTPH、KLHL22这9个代表性的自噬蛋白进行了验证,并结合其已知的生物学功能或我们初步的研究结果推测其在肺癌细胞自噬中可能的作用。结果1、通过构建的GST标签的LC3家族6个蛋白克隆进行的肺癌细胞裂解液沉淀实验和条带质谱分析共获得1705个候选蛋白。编号为LC3A-53和LC3A-65的条带鉴定结果最多,同为241个;编号GABARAPL2-121条带最少,为14个。平均为122个。根据候选蛋白氨基酸序列是否含有LIR基序进一步筛选,获得465个蛋白,占总数27%。2、465个含LIR基序的候选蛋白生物学功能查询、分组。将其整理为13个组,分别是:内膜系统和囊泡运输、能量代谢、细胞骨架与细胞运动、细胞粘附和迁移、细胞信号转导、细胞分裂与细胞周期、细胞分化、基因信息传递与蛋白质合成、转录、蛋白质修饰、蛋白质运输、细胞凋亡以及其他。其中内膜系统和囊泡运输又细分为囊泡相关、溶酶体相关、高尔基体相关、自噬相关和过氧化物酶体相关5个亚组;转录细分为内质网相关和转录调节相关2个亚组;蛋白质修饰细分为泛素化相关和羟基化相关2个亚组。3、通过综合分析从中选取了9个具有代表性的自噬蛋白,分别是:NCOA7、MAP4K2、PELP1、WDR6、MIA3、RABGAP1、BCAR3、AFTPH、KLHL22。GST-沉淀实验验证发现它们均能与LC3家族6个成员发生不同程度的结合。根据结合情况和已知功能推测其作为自噬蛋白在肺癌细胞自噬中可能的作用。4、进一步探究出了NCOA7和MAP4K2的LIR具体位点。截短体和点突变体克隆的GST-沉淀实验发现NCOA7的LIR位点有两个,分别是:（310）WEDL（313）和（747）WEII（750）。MAP4K2的LIR位点有一个,是（356）WTLL（359）。结论1、GST-LC3融合蛋白沉淀实验结合质谱分析是筛选自噬蛋白组的一种有效方法。2、不同自噬蛋白LIR数量、位置、结合情况均有不同,体现自噬在细胞功能调节中的复杂性。3、从筛选的自噬蛋白组中的蛋白组成,推断细胞自噬涉及到肺癌细胞功能的各个方面,对肺癌发生发展具有关键的作用。