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鼻咽癌(NPC)是来源于人类鼻咽上皮细胞的恶性肿瘤。它是由遗传因素、EB病毒(EBV)和环境因素等相互作用的一种复杂性疾病。先前实验均证实鼻咽癌易感基因的存在,本实验室通过对广东鼻咽癌家系全基因组连锁分析将鼻咽癌易感区定位于4p15.1-q12上。随后发现在LOC344967启动子区-32G→A与鼻咽癌连锁,该位点的变异导致APl位点的产生,并调控LOC344967的表达。SCC-112最初是由Usha Kasid实验室将KIAA0648(5177bp,GenBank accession no.AF003254)和EST序列(2247bp,GenBank accession no.Al655954)序列用Autoassembler program进行序列组装而来的一个新的基因,命名为SCC-112(GenBank accessionno.AF294791,mRNANM 015200),该基因位于鼻咽癌易感区4p14上,与鼻咽癌候选易感基因LOC344967相邻。我们推测SCC-112多态性位点或变异可能与鼻咽癌易感性相关。
研究发现SCC-112是一个细胞周期相关基因;在肾癌中大部分表达下调。但Cancer Profiling Assay结果显示SCC-112在组织中的表达存在争议。有关SCC-112的研究目前只有一篇文章报道,但其功能尚不清楚。
本论文的研究目的在于探索SCC-112与鼻咽癌的关系及SCC-112在肿瘤发生发展中的作用。
方法:
首先用RT-PCR-测序确定SCC-112两个版本的序列,PCR-测序分析SCC-112所有外显子、剪接位点、UTR区和启动子区可能存在的变异位点与鼻咽癌家系的连锁情况,甲基化特异PCR分析SCC-112启动子;荧光素酶活性检测分析启动子区变异序列的转录水平。Westem-blot确定SCC-112表达模式;体外转染SCC-112载体或siRNA干扰SCC-112表达,检测细胞生长状况来分析SCC-112的功能;免疫共沉淀分析SCC-112的相互作用蛋白;FACS分析SCC-112对细胞周期的影响。
结果:
鼻咽组织蛋白Westem-blot分析发现SCC-112存在两个表达版本,大版本(SCC-112α)分子量约150kDa,在部分鼻咽组织中表达;小版本(SCC-112β)分子量约50kDa,在检测的鼻咽组织中均表达。为了确定这两个版本的具体序列,对同时表达两个版本的组织和只表达SCC-112p的组织进行RT-PCR测序,发现版本SCC-112β比版本SCC-112α少11个外显子,两个版本的mRNA分析证实SCC-112α在鼻咽组织中呈差异性表达,而且SCC-112α在鼻咽癌组织中mRNA水平高于炎性组织;SCC-112β在鼻咽组织中呈组成性表达。
甲基化特异性PCR结果显示无论是表达或不表达SCC-112α,这些组织中SCC-112α并不发生甲基化修饰。遗传多态性分析发现SCC-112α所有外显子均未见有突变但在剪接位点中存在1个SNP,在5’UTR区中发现3个SNP,而且这3个多态性位点组成单体型与鼻咽癌家系31&34连锁。在SCC-112α的启动子区发现了多个变异位点,同时荧光素酶活性检测发现SCC-112α启动子区变异序列影响SCC-112α的转录。
肿瘤配对组织分析SCC-112表达模式进一步证实SCC-112存在两个版本,SCC-112α在肿瘤组织中表达上调。为了分析SCC-112α在肿瘤发生发展中的作用,将含有SCC-112αcDNA的载体转染细胞使得SCC-112α过表达,然后分析细胞的增殖情况,结果发现SCC-112α过表达能够促进细胞增殖。同样,siRNA沉默SCC-112α表达后细胞增殖水平受到了抑制。免疫组化结果显示SCC-112与p63共定位,免疫共沉淀结果证实两者之间直接相互作用,而且当SCC-112α表达上调的时候p63的表达水平也增加。
FACS对表达不同水平SCC-112α的细胞周期分析发现,SCC-112α与细胞周期G2/M期相相关。细胞同步化处理也证实SCC-112α与细胞周期相关,呈周期性表达。
结论:
发现并确定了SCC-112两个版本的序列,SCC-112α启动子区存在多个变异位点,这些变异序列影响SCC-112α的转录活性。SCC-112α在肿瘤组织中表达上调,促进细胞增殖具有致癌潜能;而且SCC-112α能与p63相互作用,与细胞周期G2/M期相密切相关。