研究背景:非编码RNA以RNA形式在调节基因表达中起着极为重要的作用。类似mRNA长非编码RNA(mlncRNA)稳定存在于细胞,与mRNA一样进行剪接和3’端加PolyA尾,但没有典型的开放性阅读框架。研究提示mlncRNA表达的变化和影响mlncRNA的因素改变与神经性疾病有关,但作用机制尚不清楚。糖尿病是以高血糖和高血脂为主要特征的代谢紊乱综合症,糖尿病并发心脏自主神经病变使心脏器功能异常,甚至心源性猝死,严重危害人类健康。颈上交感神经节的节后神经纤维可分布至心神经丛,影响心脏的活动。高糖高脂联合毒性介导的神经功能损伤是近年来糖尿病神经病变研究的热点,与糖毒性和脂毒性相关的慢性炎症、游离脂肪酸的增加和氧化应激等多种应激刺激,可通过直接或间接激活P38促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)等应激相关信号通路,诱导神经细胞特定非编码RNA转录,并调节与神经细胞功能相关的靶基因的表达,参与高糖高脂毒性环境下神经细胞的一系列应答反应。本研究拟对前期SOLiD高通量大鼠转录组数据库验证和序列预测筛选的糖尿病模型大鼠颈上交感神经节组织高表达的mlncRNA2进行整体和细胞水平的小干扰RNA(siRNA),通过整体、细胞和分子水平结合的技术,探寻小干扰mlncRNA2在颈上交感神经节介导糖尿病心脏自主神经病变中的作用及机制,为糖尿病心脏自主神经病变的防治提供新靶点。目的:1、采用整体水平的mlncRNA2小干扰RNA干扰技术抑制糖尿病模型大鼠颈上交感神经节组织高表达的mlncRNA2后,通过高通量表达谱芯片寻找与颈上交感神经节mlncRNA2介导糖尿病心脏自主神经病变相关的靶基因;并进一步在整体水平对表达谱芯片筛选出的与mlncRNA2显著相关的靶基因进行功能验证,探寻小干扰mlncRNA2在颈上交感神经节介导糖尿病心脏自主神经病变中的作用;2、建立高糖高脂联合诱导mlncRNA2高表达的交感PC12细胞模型,探讨P38 MAPK信号通路在高糖高脂诱导PC12细胞mlncRNA2高表达中的作用;3、以高糖高脂联合诱导mlncRNA2高表达的交感PC12细胞系为细胞模型,经细胞水平mlncRNA2小干扰后,检测整体水平筛选出的与mlncRNA2显著相关的颈上交感神经节靶基因的改变,对与整体水平变化一致的靶基因,进一步采用细胞及分子水平结合的技术,观察PC12细胞胰岛素受体底物1(IRS1)表达水平的改变,结合PC12细胞突起生长表现出的差异,分析小干扰mlncRNA2在IRS1介导高糖高脂PC12细胞突起生长抑制中的作用及机制,以期通过细胞水平的研究,验证并深入探寻整体水平筛选出的颈上交感神经节高表达mlncRNA2在介导糖尿病心脏自主神经病变中的作用及其机理;4、以高糖高脂处理的交感PC12细胞系为细胞模型,通过小RNA干扰技术抑制高糖高脂PC12细胞mlncRNA2的高表达,观察PC12细胞嘌呤P2X7表达水平的改变,结合PC12细胞内Ca2+浓度及上清液白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的变化,探讨小干扰mlncRNA2在P2X7介导高糖高脂PC12细胞炎性损伤中的作用及机制;5、以高脂处理的PC12为细胞模型,分析P38MAPK信号通路在高脂诱导PC12细胞P2X7受体表达及其介导IL-6分泌中的作用。方法:1、本实验通过建立2型糖尿病大鼠模型,并对糖尿病大鼠颈上交感神经节mlncRNA2高表达进行小RNA干扰,采用表达谱芯片技术分析mlncRNA2下调后引起颈上交感神经节细胞功能相关基因的改变,进一步通过免疫荧光双标、Real-time PCR和蛋白印迹技术对mlncRNA2小RNA干扰后改变最明显的基因进行验证,观察mlncRNA2小RNA干扰后大鼠空腹血糖和餐后血糖、血清IL-6、TNF-α、去甲肾上腺素(NE)以及氧化应激指标的变化,结合大鼠心电图、心率、血压、心率变异性及动脉血压压力敏感性等心脏自主功能表现出的差异,进一步评价小干扰mlncRNA2在颈上交感神经节介导糖尿病心脏自主神经功能损伤中的作用及可能的机制。2、采用单独高糖或高脂诱导PC12细胞模拟糖尿病神经细胞损伤,通过Real-time PCR实验观察高糖或高脂培养对PC12细胞mlncRNA2表达的时效和量效关系,确定高糖和高脂培养PC12细胞诱导mlncRNA2表达的最佳时间和浓度,并以此为基础,进一步观察比较单独高糖、高脂以及联合高糖高脂对PC12细胞mlncRNA2表达的影响,建立高糖和(或)高脂培养PC12细胞诱导PC12细胞mlncRNA2高表达的细胞模型;采用P38 MAPK特异性抑制剂SB-203580抑制P38 MAPK信号通路,Real-time PCR观察其对高糖高脂诱导PC12细胞mlncRNA2表达的影响,探讨P38 MAPK信号通路在高糖高脂诱导PC12细胞mlncRNA2表达中的作用。3、以联合高糖高脂处理的交感PC12细胞系为细胞模型,并通过小RNA干扰技术抑制其mlncRNA2的表达,采用Real-time PCR和蛋白印迹技术分析PC12细胞IRSI mRNA和蛋白表达及IRSI丝氨酸302位点磷酸化水平的改变,结合PC12细胞突起生长情况,探讨mlncRNA2在调节PC12细胞突起生长中的作用;进一步采用P38 MAPK特异性抑制剂SB-203580抑制P38MAPK信号通路的活性,通过Real-time PCR和蛋白印迹技术检测PC12细胞IRS1 mRNA和蛋白表达及IRS1丝氨酸302位点磷酸化水平的改变,观察PC12细胞突起生长的变化,以期从细胞和分子水平深入阐明小干扰mlncRNA2在IRS1介导高糖高脂PC12细胞突起生长抑制中的作用及可能机理。4、以高糖高脂处理的交感PC12细胞系为细胞模型,通过小RNA干扰技术抑制其mlncRNA2表达,Real-time PCR和蛋白印迹技术检测PC12细胞P2X7表达水平的改变,结合PC12细胞内Ca2+浓度以及上清液IL-6和TNF-α水平的变化,探讨小干扰mlncRNA2在PC12细胞功能损伤中的作用;进一步采用P38 MAPK特异性抑制剂SB-203580抑制P38 MAPK信号通路的活性,Real-time PCR和蛋白印迹技术分析PC 12细胞P2X7表达水平的变化,PC 12细胞内Ca2+浓度以及上清液IL-6和TNF-α水平的改变,以期从细胞、分子水平深入阐明小干扰mlncRNA2在P2X7介导高糖高脂PC12细胞炎性反应及功能损伤中的作用及可能机理。5、以高脂处理的交感PC12细胞系为细胞模型,采用免疫荧光、Real-time PCR和蛋白印迹法分析不同浓度高脂培养PC12细胞P2X7受体表达及P38磷酸化水平,测定不同浓度高脂培养PC12细胞内Ca2 +浓度以及细胞上清液IL-6水平的变化,分析高脂在诱导PC12细胞P2X7受体表达及其介导IL-6分泌中的作用;进一步采用P38 MAPK特异性抑制剂SB-203580抑制P38 MAPK信号通路的活性,通过免疫荧光、Real-time PCR和蛋白印迹技术检测PC12细胞P2X7受体的变化,结合PC12细胞内Ca2+浓度以及细胞上清液IL-6水平的变化,以期从细胞和分子水平深入阐明P38 MAPK信号通路在高脂诱导PC12细胞P2X7受体表达及其介导IL-6分泌中的作用;结果:1、糖尿病模型大鼠心率加快、QT间期延长和血压升高;心率变异性指标中的总功率频谱(TP),极低频(VLF)、低频(LF)和高频(HF)均有不同程度的降低,LF/HF比值增高;动脉血压压力敏感性降低;空腹和餐后血糖升高、血清IL-6、TNF-α及NE水平升高,氧化应激指标丙二醛(MDA)升高、总一氧化氮合酶(T-NOS)和谷胱甘肽过氧化物酶活性(GSH-PX)降低,提示糖尿病大鼠颈上交感神经节炎性改变和氧化应激损伤,心脏自主神经功能调节异常,而这些异常改变均在对颈上交感神经节高表达的mlncRNA2小RNA干扰处理后得到不同程度的改善。表达谱芯片结果发现14个mlncRNA2敲降后明显改变的基因,包括6个明显上调基因以及8个显著下调基因。其中缝隙连接半通道蛋白1(Pannexin-1)和IRS1基因是两个变化最大的与神经细胞生长和炎性功能损伤有关的基因,分别在mlncRNA2敲降后下调7.4618倍和上调10.1036倍。免疫荧光双标结果表明颈上交感神经节Pannexin-1和IRS1主要在神经元上表达,Real-time PCR和蛋白印迹结果均证实mlncRNA2小RNA干扰处理后,可显著地抑制糖尿病模型大鼠颈上交感神经节Pannexin-1表达的上调,抑制IRS1异常丝氨酸302磷酸化,提高下调的IRS1表达。蛋白印迹结果提示糖尿病模型大鼠颈上交感神经节p-P38水平增高,mlncRNA2小RNA干扰后可抑制糖尿病大鼠颈上交感神经节P38蛋白的活化。2、单独高糖75 mM或高脂0.75 mM培养PC12细胞3天可一定程度的诱导PC12细胞mlncRNA2的表达,而甘露醇模拟高糖所致的细胞内高渗环境并不能诱导PC12细胞mlncRNA2的表达。高糖75 mM高脂0.75mM联合培养PC12细胞3天的mlncRNA2表达分别是高糖、高脂单独培养的1.91倍和1.93倍,提示高糖高脂具有协同诱导mlncRNA2表达作用。采用P38 MAPK特异性抑制剂SB-203580抑制P38 MAPK信号通路,可抑制高糖高脂联合作用诱导的PC12细胞mlncRNA2表达的上调,提示P38MAPK信号通路可能参与诱导高糖高脂毒性环境下PC12细胞mlncRNA2的表达。3、高糖高脂联合处理导致PC12细胞突起生长抑制;对高糖高脂联合处理PC12细胞高表达的mlncRNA2小RNA干扰后,可缓解高糖高脂联合处理的PC12细胞生长的抑制。高糖高脂状态下的PC12细胞中IRS1异常丝氨酸磷酸化水平升高,IRS1表达明显下降,而高糖高脂mlncRNA2小RNA干扰后可抑制高糖高脂IRS1异常升高的丝氨酸磷酸化以及IRS1表达的下调。P38 MAPK特异性抑制剂SB-203580抑制P38 MAPK信号通路的激活,可抑制高糖高脂诱导的PC12细胞mlncRNA2高表达,降低高糖高脂PC12细胞IRS1异常丝氨酸磷酸化,改善高糖高脂PC12细胞IRS1表达下调,并促进PC12细胞突起的生长。4、高糖高脂联合处理PC12细胞IL-6和TNF-α水平升高;对高糖高脂联合处理PC12细胞诱导的mlncRNA2高表达进行小RNA干扰后,可抑制高糖高脂联合处理的PC12细胞IL-6和TNF-α水平的升高;高糖高脂状态下的PC12细胞中P2X7mRNA和蛋白表达明显升高,ATP或BzATP诱导的细胞内Ca2+浓度的升高,而高糖高脂mlncRNA2小RNA干扰后,P2X7 mRNA和蛋白明显下降;ATP或BzATP诱导的细胞内Ca2+浓度的下降;P38 MAPK特异性抑制剂SB-203580抑制P38 MAPK的活性,可抑制高糖高脂诱导的PC12细胞mlncRNA2高表达,抑制高糖高脂PC12细胞P2X7的上调、ATP和BzATP诱导的细胞内Ca2+浓度的升高以及上清液IL-6和TNF-α水平的升高。5、高脂诱导PC12细胞P2X7受体的表达、ATP和BzATP诱导细胞内Ca2+浓度升高以及IL-6的释放。通过P2X7小RNA干扰或P2X7受体特异性抑制剂BBG抑制高脂诱导PC12细胞P2X7受体的表达后,可抑制高脂培养PC12细胞ATP或BzATP诱导的细胞内Ca2+浓度的升高以及上清液IL-6的释放。蛋白印迹结果表明高脂诱导PC12细胞P38蛋白磷酸化。采用SB-203580特异性阻断P38 MAPK信号通路可抑制高脂诱导的PC12细胞P2X7受体表达、ATP和BzATP诱导的细胞内Ca2+浓度升高以及IL-6的释放。结论:1、糖尿病高糖高脂毒性相关的慢性炎症、游离脂肪酸的增加和氧化应激等多种应激刺激,可通过直接或间接激活P38 MAPK应激相关信号,调节与颈上交感神经节mlncRNA2高表达相关的Pannexin-1和IRS1的表达,参与糖尿病颈上交感神经节细胞的炎性反应与功能损伤,从而涉及mlncRNA2在颈上交感神经节介导糖尿病心脏自主神经病变的发病机制;2、高糖高脂毒性环境可联合诱导PC12细胞mlncRNA2的表达,其机制涉及应激相关P38 MAPK信号通路的激活;3、高糖高脂毒性可通过激活P38 MAPK应激相关信号,调节与PC12细胞mlncRNA2高表达相关的IRSI和P2X7基因的表达,抑制PC12细胞突起生长,引发高糖高脂PC12细胞炎性反应,从而涉及mlncRNA2介导高糖高脂PC12细胞功能损伤的分子机制。4、高脂诱导PC12细胞P2X7受体的表达及其介导的IL-6的释放,其机制涉及应激相关P38 MAPK信号通路的激活。因此,与高糖高脂毒性引发颈上交感神经节/交感PC12 mlncRNA2高表达相关的Pannexin-1、IRS1和P2X7基因可能是潜在的糖尿病心脏自主神经病变防治的新靶点。