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目的:肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,影响着全世界。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是原发性肝癌的主要组织学类型。而蛋白质翻译后修饰（post-translational modification,PTM）广泛发生在许多肿瘤转化过程的关键信号通路。磷酸化是肝细胞癌中广泛研究的蛋白质翻译后修饰。有文献报道,p65磷酸化修饰与癌症相关,促进癌症的进展。课题组前期研究结果发现:发现SUMO1修饰p65促进肝细胞癌进展。本研究旨在探究p65蛋白的两种蛋白质翻译后修饰方式之间是否有联系。如果有的话,又是什么样的联系。方法:我们先使用免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）在人肝癌组织上检测SUMO1和磷酸化p65的表达,后构建SUMO1相关的p65的SUMO化位点的突变体以及用CO-IP（Co-immunoprecipitation,免疫共沉淀）和Western Blot方法在蛋白水平上检测p65的SUMO化位点的突变体是否构建正确,用luciferase检测p65的SUMO化位点的突变体对NF-κB转录活性的影响,用MTT和细胞侵袭实验验证对肝癌细胞的恶行生物学行为的影响。根据文献报道选择p65最常见的两个磷酸化位点（第276位丝氨酸和第536位丝氨酸）,再构建相应的突变体质粒,经测序确认突变体构建成功后;用CCK8细胞增殖和细胞侵袭实验验证p65磷酸化对肝癌细胞的增殖和侵袭能力的影响。在肝癌细胞株上过表达p65野生型质粒和磷酸化位点突变的质粒,使用免疫共沉淀的方法来检测p65的磷酸化对其SUMO化修饰的影响。在肝癌细胞株上过表达p65野生型质粒和其SUMO化修饰位点突变的质粒,采用p65磷酸化位点抗体检测p65的SUMO化修饰对其磷酸化的影响。根据SUMO化修饰调节转录因子活性的模型,当转录因子在细胞核内发生SUMO化修饰之后,可以招募抑制性蛋白来抑制转录因子的活性。本课题组前期发现中脑星型胶质细胞来源的神经生长因子（MANF）在胞核内能抑制NF-κB转录活性,但没有核定位序列的MANF如何进入细胞核,是否需要SUMO化修饰的参与,于是构建了MANF的SUMO化修饰位点突变的突变体,采用免疫共沉淀实验确认MANF的SUMO化修饰位点。使用细胞免疫荧光检测MANF的SUMO化位点突变之后对MANF定位的影响。用luciferase检测MANF的SUMO化位点突变之后对NF-κB的转录活性的影响。结果:1.在肝癌组织中SUMO1的表达与p65的磷酸化表达是一致的免疫组织化学结果提示在HCC中SUMO1蛋白的表达与p65蛋白的S276位点磷酸化是一致的,在HCC中SUMO1蛋白的表达与p65蛋白的S536位点磷酸化也是一致的。2.构建p65 SUMO化修饰位点突变的突变体质粒,并验证修饰位点以及SUMO1相关的p65的SUMO化对NF-κB的转录活性的影响由于p65核转移能激活NF-κB转录活性,同时SUMO1蛋白能促进p65核转移,因此我们想探讨p65发生SUMO化修饰后对NF-κB转录活性是否有影响。于是我们构建了p65 SUMO化修饰位点突变的质粒,结果发现当p65 SUMO化修饰位点突变后NF-κB转录活性上调。那么就说明了p65 SUMO化修饰是抑制NF-κB转录活性,这与我们之前的设想SUMO1促进p65核转移上调NF-κB转录活性是不符的。我们考虑到在肝癌细胞中除了有SUMO1蛋白之外,还有SUMO2/3蛋白;为了探讨SUMO1蛋白相关的p65 SUMO化修饰,我们在肝癌细胞当中采用过表达SUMO1以及敲低SUMO2/3的方式去增加细胞中SUMO1相关的SUMO化修饰水平。在这种情况下,那么p65的SUMO化修饰位点突变后,NF-κB转录活性是低的,说明SUMO1相关的p65 SUMO化修饰能上调NF-κB转录活性。3.SUMO1相关的p65的SUMO化修饰对肝癌细胞的恶行生物学行为的影响NF-κB的转录活性与肝癌的进展有关,于是采用了MTT细胞活力检测实验和细胞侵袭实验验证,过表达SUMO1或者是敲低SUMO2/3,用于探讨SUMO1相关的p65的SUMO化修饰对细胞的影响。结果发现SUMO1相关的p65的SUMO化修饰位点突变后,细胞活力和侵袭能力有一定的减弱。说明SUMO1相关的p65的SUMO化修饰促进肝癌的进展。4.构建p65磷酸化位点突变的质粒和验证p65磷酸化对肝细胞癌的影响构建成功后的质粒转染到Hep G2肝癌细胞株中,转染FLAG-p65-S276A位点突变的质粒和FLAG-p65-S276,536A共同突变的质粒相比转染p65野生型的质粒,细胞的增殖能力受到了抑制,而转染FLAG-p65-S536A位点突变的质粒较转染p65野生型的质粒,细胞增殖能力没有明显变化。细胞侵袭实验发现转染突变质粒的细胞,侵袭能力都受到了不同程度的抑制。证明p65磷酸化促进肝癌的进展。5.p65的SUMO化与磷酸化之间的交互调控作用p65的SUMO化修饰位点突变之后,发现p65的磷酸化（276位点）表达是减少的,也就是SUMO1相关的p65的SUMO化修饰对p65的磷酸化（276位点）表达有促进作用,说明p65 SUMO化修饰促进p65的磷酸化。P65的磷酸化位点突变之后,p65的SUMO化修饰减少,说明p65磷酸化是促进它的SUMO化修饰的。6.MANF的SUMO化修饰位点突变之后对MANF定位以及NF-κB的转录活性的影响MANF的SUMO化位点突变之后,MANF都在细胞浆内。MANF的SUMO化修饰是抑制NF-κB的转录活性的。说明,MANF抑制NF-κB的转录活性是需要通过SUMO化修饰去介导MANF入核之后才会发生的。结论:在肝癌组织中SUMO1的表达与p65的磷酸化表达是一致的,SUMO1相关的p65的SUMO化修饰对肝癌有促进作用,然后构建p65磷酸化位点突变的质粒和验证p65磷酸化对肝细胞癌也有促进作用。p65的SUMO化与磷酸化交互调控表现为:SUMO1相关的p65的SUMO化修饰对p65的磷酸化的276位点有促进作用,说明p65的SUMO化修饰促进p65蛋白第276位丝氨酸位点的磷酸化。p65的磷酸化位点突变之后,SUMO1蛋白相关p65的SUMO化修饰减少,p65磷酸化促进SUMO1相关的p65的SUMO化修饰。而MANF抑制NF-κB的转录活性是需要通过SUMO化修饰去介导MANF入核之后才会发生的。