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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,在我国其发病率占恶性肿瘤的第3位,死亡率居第二位。近年来随着HCC高危人群的确立,以及影像技术的进步与发展,早期肝癌的发现率明显增加,根治性手术切除率亦明显提高,但术后高复发率已成为制约其疗效的瓶颈,因HCC肿瘤细胞的高侵袭、转移能力所导致的术后复发与转移也是治疗的主要难点,因此深入研究促进HCC侵袭、转移的相关分子机制,对指导和完善肝细胞癌的临床治疗流程具有重要意义。 相对于正常肝细胞,HCC细胞中上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)表达减少甚至缺失,与肿瘤的进展密切相关,但在肝癌中E-cadherin下调的机制还不完全清楚。E-cadherin是通过E-cadherin复合体发挥作用,复合体中还包括四种连环蛋白(catenin),其中α-连环蛋白主要连接E-cadherin胞浆段,将其与细胞内骨架连接在一起并起到重要作用。研究显示,α-连环蛋白不仅在维持E-cadherin复合体的功能中起到重要作用,其在胞浆和胞核中的表达还对β-连环蛋白/TCF信号通路的作用存在重要的调节作用,并对肿瘤细胞Wnt通路激活、细胞的增殖以及侵袭转移产生影响。研究发现α-连环蛋白和β-连环蛋白在细胞浆内的相互作用对各自的蛋白质代谢存在影响,从而影响到细胞的生物学行为。β-连环蛋白的降解是泛素化依赖性的,而α-连环蛋白的降解则是非泛素化依赖性的,即通过蛋白水解作用实现。Hwang等人的研究显示当二者出现蓄积时在胞浆和胞核内形成复合体,该复合体的形成反过来进一步抑制α-连环蛋白的蛋白水解,同时还能抑制β-连环蛋白/TCF的转录活性,并抑制Wnt通路的激活。 Armc8(armadillo repeat containing8,犰基重复蛋白8)是CTLH复合体的关键组成分子,该复合体在泛素化和蛋白酶体依赖性的果糖-1,6-二磷酸酶的降解中起到重要作用。研究发现Armc8能与α-连环蛋白结合,在细胞内与α-连环蛋白及β-连环蛋白共同定位于细胞膜上。α-catenin氮末端82-148位氨基酸既能与β-连环蛋白结合,也能与Armc8结合。Armc8与α-连环蛋白结合后引起α-连环蛋白快速降解,这一降解过程是经由蛋白酶体实现的,而敲除Armc8表达后能够抑制α-连环蛋白的降解。我们发现Armc8在肝细胞癌中相对于肝细胞是过表达的,但其在肝细胞癌中的作用和机制还不清楚。从目前仅有的几篇关于Armc8文献的分析,我们设想,Armc8可能通过影响肝细胞癌中α-连环蛋白的表达(促进其降解)从而影响E-cadherin复合体的功能;另一方面可能通过影响α-catenin表达进一步影响β-catenin蛋白水平及β-catenin/TCF转录活性。通过上述可能存在的两种机制,最终促进癌细胞侵袭及增殖等恶性表型的获得。 本研究旨在揭示Armc8在肝细胞癌中的表达、临床意义及可能存在的影响E-cadherin复合体功能的机制,初步探讨其可能具有的促进肿瘤进展的临床病理学意义以期寻找新的临床治疗的潜在靶点。 材料与方法: 1、石蜡组织标本 原发性肝癌组织(102例)及癌旁肝组织(65例)均来自中国医科大学附属盛京医院外科手术切除标本(2007-2011年),患者术前均未接受放、化疗及介入治疗。病例有完整相关临床资料。 2、细胞系 肝细胞Bel-7402及肝癌细胞HepG2、HCC97L和SMMC-7721等细胞系用于体外细胞学研究 3、免疫组化 按链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(S-P)法的试剂盒说明书步骤进行操作。以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定:同时观察染色强度(I)和染色范围(S)。染色强度分为强、中等、弱三个级别。染色范围并分为0-4四个等级,范围如≥10%记为阳性,其中<10%记为0分,同时代表阴性,10%≤S<25%记为1分,25%≤S<50%记为2分,50%≤S<75%记为3分,75%≤S记为4分。最后计算染色强度及范围的乘积作为表达水平,进行统计学分析。 4、构建干扰序列转染肝癌细胞(siRNA) 整个siRNA的转染的实验过程都使用无RNase的耗材及试剂,保证每个实验步骤不受RNase的污染。转染前一天接种HepG2细胞,使其在第二天转染时细胞密度达到30%-50%之间。转染当天用Opti-MEM培养基稀释siRNA,终浓度达到100nM,轻轻吹打混匀。用Opti-MEM培养基稀释转染试剂LipofectamineTM-2000,轻轻吹打混匀,室温静置5分钟。其中LipofectamineTM-2000(μl)∶siRNA(nM)∶Opti-MEM(μl)=1∶20∶50。混合LipofectamineTM2000和siRNA稀释液,轻轻吹打混匀,室温静置20分钟。将转染混合液加入已换好液的HepG2细胞中,前后轻摇细胞板混合均匀。细胞板置于CO2恒温培养箱中培养,6-8小时后换上新鲜无抗生素培养基继续培养至72小时,最后收集细胞。 5、免疫荧光染色 将接种在24孔板中的细胞用PBS冲洗,用4%的多聚甲醛于冰上固定20分钟。洗过后用0.2%的TritonⅩ-100于常温打孔15-30分钟,之后用PBS冲洗。打孔后用1%的BSA常温封闭30分钟。封闭完后弃去封闭液加入一抗于4℃孵育过夜。PBS冲洗后在暗室中加入二抗(异硫氰酸荧光素(FITC)标记的IgG)。PBS冲洗后,加入DAPI染液进行核复染。PBS冲洗后,用荧光显微镜观察。 6、Western Blot 获得收集的HepG2细胞,按体积比1∶5加入蛋白裂解液,用超声仪粉碎细胞,离心后收集上清。测定蛋白浓度后将含40-80ug总蛋白的裂解产物进行10%SDS-PAGE电泳,后转印至硝酸纤维素膜,用5%脱脂奶粉封闭2h,之后用一抗(Armc8,α-catenin,β-catenin,E-cadherin)孵育过夜。蛋白含量通过增强化学发光法检测并取其与GADPH的比值作为蛋白的相对表达量。 7、Transwell侵袭实验 于无菌条件下将胶体加入上室,确保均匀覆盖底部,于温箱静置2小时。取100ul HepG2细胞悬液(5×106个/ml)滴入上室内,下室加入培养液,将小室置37℃,5% CO2条件下放置,24小时后弃去上室内液体,擦尽胶,100%甲醇固定15分钟,常规苏木素染色,光镜下计数细胞数。实验重复三次。 8、统计学分析 采用SPSS for windows13.0统计分析软件进行分析。p<0.05为有统计学意义。 结果: 1、Armc8在肝细胞癌的表达明显高于癌旁肝组织细胞 免疫组化实验显示Armc8表达定位于细胞浆,少数有细胞膜表达,在肝细胞癌中表达的阳性率为53.9%(55/102),显著高于癌旁肝组织9.2%(6/65)(p<0.05)。 2、Armc8在肝细胞癌中的表达与病理分化程度、TNM分期、BCLC分期、肿瘤数目、肿瘤大小以及主要血管侵犯密切相关。 Armc8在肝细胞癌中的表达与癌细胞分化程度、TNM分期、BCLC分期、肿瘤数目、肿瘤大小以及主要血管侵犯相关。癌细胞中低分化组(76.79%,43/56)高于高分化组(26.09%,12/46)(p<0.05)。高TNM分期组(Ⅱ+Ⅲ组)(70.73%,29/41)高于低分期组(Ⅰ组)(42.62%,26/61)(p<0.05)。多发肿瘤组(72.41%,21/29)高于单发肿瘤组(46.57%,34/73)(p<0.05)。术前证实主要血管侵犯组(76.47%,13/17)高于无血管侵犯组(49.41%,42/85)(p<0.05)。肿瘤直径≥5厘米组(70.90%,39/55)高于<5厘米组(24.04%,16/47)(p<0.05)。Armc8在肝细胞癌中的表达与患者的年龄、性别、感染病毒、AFP水平、肝硬化等指标无明显相关性(p>0.05)。 3、Armc8调节E-cadherin及下游靶基因的表达 用Armc8 siRNA转染HepG2细胞进行干扰Armc8表达,发现下调Armc8蛋白表达的同时,明显上调E-cadherin复合体中各蛋白含量,肝癌细胞中α-catenin、β-catenin、E-cadherin表达水平相对于未干扰组显著升高(p<0.05)。 4、免疫荧光检测Armc8基因沉默后上调E-cadherin细胞膜的定位 Armc8基因沉默后的HepG2细胞在免疫荧光检测中显示Armc8细胞膜定位下调的同时,E-cadherin细胞膜定位较对照组明显上调。 5、Armc8调节肝癌细胞增殖及侵袭能力 通过Transwell方法检测癌细胞侵袭能力发现,下调Armc8蛋白表达后癌细胞侵袭能力相比未干扰组显著下降(p<0.05)。 结论: 1、Armc8在肝癌组织中相对于癌周肝组织中高表达。 2、Armc8在肝癌中的高表达与高肿瘤临床分期及肿瘤侵袭相关。 3、干扰Armc8在肝癌中的表达能调节E-cadherin及其复合体成员的表达。 4、干扰Armc8在肝癌中的表达能影响E-cadherin的定位。 5、干扰Armc8在肝癌中的表达能显著减弱癌细胞的侵袭能力。