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水稻(Oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一,每年种植面积约一亿五千万公顷。稻瘟病菌引起的稻瘟病是目前水稻生产上最严重的病害,其分布遍及世界各稻作区,每年约造成10-30%的水稻产量损失,对世界的粮食安全构成了危胁。控制稻瘟病在目前仍是世界性的难题,尚需要深入了解该病菌致病的分子生物学及其与水稻互作的机理作为基础。
在田间条件下,稻瘟病菌主要以无性方式繁殖,分生孢子是其主要的侵染源。稻瘟病菌通过一种被称为附着孢的侵染结构侵入寄主组织,以活体营养的方式在植株体内扩展,最终造成寄主组织坏死斑,并在病斑处形成大量的分生孢子,从而对邻近的植株开始新一轮的侵染过程。稻瘟病菌可以侵染水稻的叶、茎、花序甚至根系等器官。
稻瘟病菌基因组序列测序工作已经完成(Dean,2005)。基因组序列为比较基因组学、功能基因组学和致病机理研究提供了广阔的平台,必将极大地推动稻瘟病菌分子生物学和病理学的研究。在过去十几年间,稻瘟病菌致病的分子机理研究得到了很大的进步。伴随着稻瘟病菌基因组测序任务的完成,大量与侵入寄主以前相关的致病基因得到了鉴定,两条控制附着孢分化的信号传导途径已经廓清,侵入与扩展相关的基因已有了一定的发现,但仍存在很多挑战。
本研究中,通过ATMT技术成功转化了稻瘟病菌并建立了一个含6179个转化株的突变体库。通过筛选,获得了34个单拷贝T-DNA插入的突变体,确定了每个突变体的T-DNA在基因组上的插入位置,并因此找到30个可能与致病、产孢相关的基因。遗传互补试验初步表明,突变体的表型由T-DNA插入相关基因位点引起的。
基于这些研究材料,我们对一个与孢子发育相关的基因和一个与致病相关的基因进行深入研究,以期在控制稻瘟病方面提供新的理论依据.
分生孢子在稻瘟病发生上占据着重要的地位。在过去几十年间,人们只鉴定了少数与孢子发生相关的基因,对分生孢子发生的调控路径并不清楚.本章描述了一个完全失去孢子形成能力的稻瘟病菌T-DNA插入突变体,该突变体不能发育分生孢子梗,因此将该突变体命名为conidiophore stalk-less1(cos1)。遗传互补实验表明T-DNA插入到COS1基因的编码序列中导致该突变表型。COS1推测编码一个491个氨基酸的锌指蛋白,该蛋白定位于细胞核。Cos1p可能是一个分生孢子发生的转录调控因子,调控分生孢子梗的分化。菌丝体接种试验表明COS1基因在致病过程中并非必需,但COS1的缺失反而引起其菌丝体具备更强的侵染性,比如能侵入未有创口的水稻叶片.细胞学观察发现cos1突变体在叶鞘表皮细胞上能产生一种类附着孢的结构,推测其与菌丝体的侵染有关。
分泌性蛋白或效应蛋白在稻瘟病菌致病过程中的作用是目前稻瘟病菌研究的一个热点。真核生物的多数分泌性蛋白和膜定位蛋白在抵达目的地之前首先被转运到内质网进行加工熟化。蛋白前体通过内质网膜需要多种蛋白组分参与完成,是一个主动运输的过程,在酵母中,Sec62p是内质网膜上的一个跨膜蛋白,参与蛋白前体翻译后转运到内质网的运输过程。本研究从稻瘟病菌T-DNA插入突变中发现了一个致病力丧失突变体M1575,通过T-DNA侧翼序列分析和遗传互补,证明T-DNA插入到稻瘟病菌注释基因MGG_D6172.6的启动子区导致该突变表型。该注释基因预测编码一个See62p蛋白,因此将该基因命名为MoSEC62。在突变体M1575中,MoSEC62的表达受到了下调。亚细胞定位结果表明,MoSEC62p-GFP融合蛋白定位于稻瘟病菌内质网膜。M1575在附着孢形成和渗透调节上存在一定缺陷,但仍具备侵入表皮细胞的功能,但侵染菌丝(Invasivehyphae)不能正常扩展。对培养基上清蛋白分析发现,M1575突变体的一些蛋白分泌受阻。因此推测,MoSEC62的表达下降可能导致与致病相关的某些蛋白分泌受阻,从而使侵染菌丝不能在寄主细胞扩展。