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蝴蝶兰是具有较高观赏价值和经济价值的花卉,在国内外花卉市场深受欢迎。尽管常规杂交育种已培育出大量蝴蝶兰品种,但部分性状仍需通过其它途径进行改良。原生质体融合可以获得不同种属材料间遗传性状的融合,但目前该技术尚未成熟。此外,随着蝴蝶兰全基因组测序的完成,蝴蝶兰重要功能基因的后续分析及转移显得尤为重要。基因的瞬时表达是建立在获得高质量原生质体的基础上,研究基因结构和功能的重要手段,因此在蝴蝶兰中建立稳定的原生质体瞬时表达体系将使蝴蝶兰在生物学相关领域研究中发挥重要作用。本研究以蝴蝶兰无菌苗幼嫩叶片为材料,采用酶解法对蝴蝶兰叶肉细胞原生质体的分离及融合条件进行研究,并利用PEG介导法将外源基因转化到原生质体中进行瞬时表达分析。通过对影响蝴蝶兰叶肉细胞原生质体分离、融合以及基因瞬时表达的相关因素进行了研究,初步建立了蝴蝶兰叶肉细胞原生质体分离、融合及瞬时表达体系,为进一步开展细胞与分子生物学操作提供参考。试验结果如下:1.蝴蝶兰叶肉细胞原生质体分离条件:以蝴蝶兰无菌苗幼嫩叶片为材料进行原生质体的分离,通过正交试验研究了纤维素酶OnozukaR-10、离析酶OnozukaR-10、甘露醇浓度与酶解时间对原生质体分离产量与存活力的影响。结果表明:纤维素酶R-10浓度与酶解时间是影响原生质体产量的关键因子,蝴蝶兰原生质体分离的最优组合条件为 1.0%‘Onozuka’R-10,0.7%‘Onozuka’R-10,0.4M 甘露醇,酶解时间为 6h,验证结果显示该组合获得原生质体的存活产量最高,平均达到5.944×106-1FW,此时细胞碎片数量也最少。2.蝴蝶兰叶肉细胞原生质体融合的最佳条件:以不同花色的两个蝴蝶兰品种’CQY’和‘780’的无菌苗叶片提取的原生质体进行融合试验,通过单因素分析法探讨了 PEG浓度、种类以及融合时间对蝴蝶兰叶肉原生质体融合效果的影响。结果显示蝴蝶兰叶肉细胞原生质体以PEG、高Ca2+-高pH融合法诱导融合时,选用浓度为35%的PEG6000作为融合剂,处理时间为20min时,蝴蝶兰原生质体融合率最高,可达35.93%,且对原生质体的融合效果较好。3.蝴蝶兰叶肉细胞原生质体瞬时表达体系的建立:采用PEG法将质粒pUC-GFP与质粒pGreen-GFP转入蝴蝶兰叶肉细胞原生质体进行瞬时表达。分析了 PEG终浓度、PEG处理时间、质粒DNA含量、原生质体密度对转化的影响。结果发现,转化效率在一定范围内随PEG浓度、质粒DNA含量、保温时间的增加而呈上升趋势,当转化体系中PEG终浓度为20%,质粒DNA含量为20μg,原生质体密度为2×105个/mL,保温30min转化效率最高,可达38.30%。