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水稻橙叶病(Rice Orange Leaf Disease,ROLD)是一种由植原体(Phytoplasma)引起的病害,上世纪80年代末至90年代初,该病曾在华南局部地区流行成灾,对水稻生产造成严重危害,此后的十多年里未见其严重发生的报道。早期研究认为,该病仅由电光叶蝉(Inazuma dorsalis)传播,但本研究室近年发现,可能因病菌变异,该病也可经黑尾叶蝉(Nephotettix cinticeps)高效传播。由于病害获得了新介体的传播能力,监测其发生流行动态并建立病菌快速检测技术十分必要。为此,本研究对华南地区进行了广泛的田间调查,明确了该病的分布与发生现状;采用深度测序的方法获得了病菌近全长基因组序列;以水稻橙叶植原体侵染必需的细胞分裂蛋白基因序列为靶标,开发了病菌特异PCR检测技术;同时建立了同步检测水稻植株及单头叶蝉体内水稻橙叶植原体和水稻瘤矮病毒的双重一步RT-PCR检测方法。主要结果如下:1、明确了华南地区水稻橙叶病分布区域及发生现状。2015年早稻、晚稻及2016年早稻生长期间,对华南稻区进行了广泛的田间调查,结果显示,水稻橙叶病发生区域明显扩大,除老病区粤西南和桂东南外,在粤西、粤北、珠三角地区及海南中部均发现该病,部分地区发生偏重,以粤西南的罗定市受害最重。结合对田间传病介体,尤其是新介体黑尾叶蝉发生情况的调查,推测水稻橙叶病极有可能我国南部稻区存在流行成灾的高风险。2、获得了水稻橙叶植原体基因组近全长核苷酸序列。以基于病菌16S rDNA序列设计的引物进行半定量巢式PCR检测,结果表明,分蘖期水稻病株完全现症叶片的叶鞘组织病菌含量最高,其次为病叶主脉,再次为叶片组织。采集完全显症叶片叶鞘组织,抽提总DNA,经超声波处理随机打断后,采用illumina HiseqTM2000测序平台对总DNA进行深度测序,获得6.525G Clean reads,以洋葱黄化植原体全基因组为参考序列,利用生物信息学软件筛选并组装为60条平均长度为9389nt的Contigs,最终获得了长度约607385bp的水稻橙叶植原体框架序列,推测该框架序列占基因组全长70%以上。3、建立了水稻橙叶病PCR检测方法与同步检测水稻橙叶植原体和水稻廇矮病毒的双重一步RT-PCR方法。选取水稻橙叶病植原体侵染必需的细胞分裂蛋白基因,设计引物建立ROLP的PCR检测方法,扩增产物大小为492bp,可经琼脂糖凝胶电泳清晰判别,检测灵敏度为10-3每100mg病叶组织总DNA提取物与10-1单头介体叶蝉总DNA提取物。水稻橙叶病和瘤矮病均经电光叶蝉和黑尾叶蝉传播,两病常常混合发生,本研究利用水稻橙叶病植原体细胞分裂蛋白与水稻瘤矮病毒复制必需的P8基因为靶标,设计特异引物,建立了双重一步RT-PCR检测方法,该方法可特异性地从水稻病样及带菌(毒)叶蝉总RNA抽提物中扩增获得相应病原基因片段。