本研究旨在通过试验发现TtAPuX21的功能，即证明TtAPuX21是否确为有功能的碳水化合物结合结构域(Carbohydrate-BindingModule，CBM)。这将为进一步研究TtAPuX21与碳水化合物的化学键结合专一性，以及其与碳水化合物相互结合的机理打下前期基础。以热产硫化氢高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacterthermohydrosulfuricus)菌液为模板，用ExTaqHSDNA聚合酶对Ttapux21进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃预变性5min，然后按94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸5min。扩增产物经1﹪琼脂糖凝胶电泳，发现在约400bp处有一明显的特异扩增片段，与预期的片段大小基本一致。 PCR产物和表达载体pET21a(+)经NdeⅠ、XhoⅠ双酶切后，混匀，加入T4DNA连接酶，16℃，连接16h。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。 从转化平板上挑3个单菌落，进行LB液体培养；然后做菌液PCR，进行阳性克隆的初步筛选，结果显示：3个单菌落均有一约400bp的特异片段，与预期的片段大小基本一致。取经菌液PCR筛选到的其中1个阳性克隆培养液，进行DNA测序鉴定，插入片段序列正确，获得的重组DNA命名为pEX21。接种转化有pEX21的菌种于LB液体培养基中培养；然后提重组质粒pEX21，并将其转化到Tuner感受态细胞中。 挑pEX21/Tuner单菌落，接种于LB液体培养基中，培养至OD600为0.6～0.8。加入IPTG，使终浓度为0.1mM，30℃，130rpm继续培养5h。用同样方法诱导表达pET21a(+)/Tuner，作为对照。取菌体总蛋白和无细胞液(Cell-FreeExtract，CFE)，同时取未诱导的菌体总蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SodiumDodecylsulphate-PolyacrylamideGelElectrophoresis，SDS-PAGE)，结果显示：pEX21/Tuner经IPTG诱导后，菌体总蛋白和CFE在分子量约20KDa处均有一条宽而明亮的蛋白质条带，与TtAPuX21融合蛋白的预期分子量近似；而对照菌pET21a(+)/Tuner和未诱导的pEX21/Tuner无此条带，说明获得了目的蛋白的高效表达。 取20ml诱导菌液，离心收获细菌细胞，裂解后将含融合蛋白的CFE加入到TalonTM树脂中，进行金属离子亲和层析(MetalIonAffinityChromatography，MIAC)，分离纯化带组氨酸标签的融合蛋白。取纯化产物做SDS-PAGE检验，结果显示：10mM～200mM咪唑洗脱液均为单一蛋白质条带，与TtAPuX21融合蛋白的预期分子量近似，其中50mM咪唑洗脱液和100mM咪唑洗脱液的条带宽而明亮，说明50～100mM咪唑洗脱液比较适合用于洗脱融合蛋白。 以多种碳水化合物为底物，通过非变性亲和电泳(Non-DenaturingAffinityElectrophoresis，NDAE)来检验TtAPuX21是否能与水溶性碳水化合物结合，分定性分析和定量分析两种；通过SDS-PAGE来检验TtAPuX21是否能与不溶性碳水化合物结合。 在两张聚丙烯酰胺凝胶中，对照胶无淀粉，试验胶含0.2﹪淀粉，以牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin，BSA)作为对照蛋白，进行NDAE的定性分析。结果显示：BSA在两张凝胶中的迁移距离相等，而TtAPuX21在试验胶中的迁移距离小于其在对照胶中的迁移距离，表明TtAPuX21能与试验胶中的淀粉结合，使其迁移受到阻碍，从而导致迁移速度变慢，迁移距离变小。同样方法表明TtAPuX21能与糊精、普鲁兰糖结合。 NDAE的定性分析表明：TtAPuX21能与水溶性淀粉、糊精和普鲁兰糖结合，因此分别以不同浓度的水溶性淀粉、糊精和普鲁兰糖为底物，进一步做NDAE的定量分析，检验TtAPuX21与它们结合能力的强弱。 分别以0.006﹪、0.012﹪、0.025﹪、0.050﹪和0.100﹪水溶性淀粉为底物，仍以BSA作为对照蛋白，做NDAE定量分析。结果显示：BSA在每一张凝胶中的迁移距离相等；而淀粉浓度越高，TtAPuX21在凝胶中的迁移距离越小，表明其迁移受到的阻碍越大。以淀粉浓度C(0.000﹪)为自变量(x)，TtAPuX21在对照胶中的迁移距离D与其在试验胶中的迁移距离d之差D-d(mm)为依变量(y)，对C和D-d进行直线回归分析。计算表明：两变量C和D-d存在显著的直线回归关系，直线回归方程为(y)=2.176+0.192x。从回归系数可知：淀粉浓度C每增加0.001﹪，迁移距离之差D-d增大0.192mm，因TtAPuX21在对照胶中的迁移距离D不变，故其在试验胶中的迁移距离d减少0.192mm。简而言之，淀粉浓度C每增加0.001﹪，TtAPuX21在试验胶中的迁移距离d减少0.192mm。 分别以0.006﹪、0.012﹪、0.025﹪、0.050﹪和0.100﹪糊精为底物，做NDAE定量分析，结果表明：糊精浓度C每增加0.001﹪，TtAPuX21在试验胶中的迁移距离d减少0.111mm。 分别以0.050﹪、0.100﹪、0.200﹪、0.300﹪和0.400﹪普鲁兰糖为底物，做NDAE定量分析，结果表明：普鲁兰糖浓度C每增加0.001﹪，TtAPuX21在试验胶中的迁移距离d减少0.025mm。 综上所述，水溶性淀粉、糊精和普鲁兰糖浓度C每增加0.001﹪，TtAPuX21在试验胶中的迁移距离d分别减少0.192mm、0.111mm和0.025mm；表明TtAPuX21在试验胶中受水溶性淀粉的阻碍程度最大，受糊精的阻碍程度次之，受普鲁兰糖的阻碍程度最小；反应出TtAPuX21与水溶性淀粉的结合能力最强，与糊精的结合能力次之，与普鲁兰糖的结合能力最弱。 分别以不溶性淀粉和不溶性木聚糖为底物，通过SDS-PAGE来检验TtAPuX21是否能与它们结合。取TtAPuX21蛋白，与不溶性淀粉混合，冰上孵育1h，漂洗数次，再经SDS变性处理后得样品，进行SDS-PAGE检验。结果显示：SDS处理获得的样品其泳道没有蛋白质条带，表明TtAPuX21不能与不溶性淀粉结合。同样方法表明TtAPuX21不能与不溶性木聚糖结合。 本研究通过试验发现：(1)TtAPuX21能与水溶性淀粉、糊精和普鲁兰糖结合，与水溶性淀粉的结合能力最强，与糊精的结合能力次之，与普鲁兰糖的结合能力最弱。(2)TtAPuX21不能与不溶性淀粉和不溶性木聚糖结合。(3)TtAPuX21是一个有功能的碳水化合物结合结构域，是一个功能性的CBM34。