附着胞是玉米大斑病菌重要的侵染结构,附着胞黑色素化是其成熟的重要标志。DHN黑色素是玉米大斑病菌重要的毒力因子,其合成途径受多种酶共同调控,其中小柱孢酮脱水酶可以将小柱孢酮脱水形成三羟萘,也可以将柱孢醌脱水成为二羟萘,在黑色素代谢过程中发挥至关重要的作用。玉米大斑病菌中究竟存在几个StSCD基因以及它们各自发挥什么样的功能还尚未可知。本研究利用玉米大斑病菌野生型菌株Et28A的全基因组数据,获得StSCD基因家族的全序列,并与玉米小斑病菌、水稻稻瘟病菌、瓜类炭疽病菌等真菌的小柱孢酮脱水酶进行了蛋白序列比对,预测了StSCD基因家族的功能;通过分析玉米大斑病菌不同附着胞发育时期StSCDs基因的表达量,明确了与玉米大斑病菌附着胞黑色素化及病菌侵染过程相关的StSCD基因;利用SCD抑制剂Carpropamid处理玉米大斑病菌,测定了 SCD缺失对菌落生长速度、黑色素合成量、附着胞膨压的影响;通过创制玉米大斑病菌主要StSCD基因敲除突变体,进一步确定了StSCD基因在附着胞发育及黑色素化过程中的作用;创制了玉米大斑病菌关键StSCD基因过表达突变体,并对其标记绿色荧光蛋白（GFP）,通过荧光观察,探索玉米大斑病菌StSCD合成转运机制;构建StSCDs原核表达载体,优化诱导条件,为进一步确定StSCD蛋白功能奠定基础。主要研究结果如下:1.玉米大斑病菌基因组中存在4个StSCD基因,均具有SCD保守位点,但同源性差异较大。通过对玉米大斑病菌全基因组搜索,共查询到4个StSCD基因,所有基因均具有SCD功能结构域,通过多序列比对发现StSCD家族具有序列相同的保守位点,其中StSCD1、StSCD2、StSCD4中催化作用保守氨基酸残基分别为 Tyr-131、Tyr-132、Tyr-133,与稻瘟病菌（Pyricularia grisea）PgSCD的保守位点Tyr-135一致,而StSCD3中对应氨基酸残基为Phe-141,与灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的SCD2蛋白相同。系统发育树分析发现,StSCD3与灰葡萄孢中SCD2蛋白具有较高同源性,StSCD4与多主棒孢酶（Corynesporacassiicola）的SCD蛋白具有较高同源性,StSCD1和StSCD2与这些已知功能的SCD同源性较低。2.StSCDs基因表达量在附着胞时期显著上升,其中StSCD3、StSCD4表达量较高。通过分析病菌生长发育过程中不同时期StSCDs基因的表达量发现,菌丝时期与芽管时期StSCDs基因的表达量均较低,在附着胞时期4个StSCD基因表达量都上调,其中StSCD3、StSCD4表达量上调尤为显著,附着胞形成6h后,StSCDs基因的表达量均显著下降,并且在附着胞诱导整个时期StSCD3与StSCD4的表达量都显著高于同一时期的StSCD1与StSCD2基因的表达量。3.SCD蛋白抑制剂影响病菌黑色素合成、生长发育、附着胞膨压。抑制剂Carpropamid处理玉米大斑病菌后,菌落颜色明显变浅,浓度越高,菌落生长愈发受到抑制。同时,抑制剂处理后附着胞形成与黑化时间明显延迟,随着抑制剂浓度的增加,附着胞膨压及黑色素含量都显著降低。4.创制了StSCD3基因敲除突变体,StSCD3缺失后生长发育及黑色素形成都有明显影响。与野生型菌株相比,△StSCD3菌株气生菌丝明显减少,新生菌丝主要紧贴培养基表面进行生长;附着胞形成明显滞后,附着胞膨压显著降低,黑色素含量也显著降低。5.创制了StSCD3、StSCD4基因过表达突变体,荧光检测发现StSCD在细胞质中合成,并通过内涵体转运至细胞壁上。荧光观察其原生质体绿色荧光定位于细胞质中,原生质体萌发12h后的幼嫩菌丝中绿色荧光定位于细胞质中,在成熟菌丝中,绿色荧光定位于细胞壁上,但StSCDs基因不存在信号肽,推测小柱孢酮脱水酶依靠内涵体携带被运输到细胞壁上进行后续酶促反应。6.构建了StSCDs基因的原核表达载体,并使用IPTG进行诱导,分别在0 h、3h、4h、5h、6h、24 h 取样,经 SDS-PAGE 检测发现,StSCD1、StSCD2 和StSCD4在诱导5h时蛋白表达量最大,蛋白大小分别为23 kD、22 kD和26kD;StSCD3在诱导6 h时蛋白表达量最大,蛋白大小为23 kD。