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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是革兰氏阳性细菌(G+),在其芽胞形成同时会产生伴胞晶体,这种伴胞晶体含有一种或几种杀虫晶体蛋白,对双翅目、鳞翅目、鞘翅目和直翅目等昆虫具有毒性。Bt作为一种环境友好,高效的微生物杀虫剂被广泛应用于农林业害虫防治中。但是由于目前Bt杀虫剂品种较单一,杀虫谱较窄,杀虫速度相对较慢,影响了生物杀虫剂的生产和应用,因此需要发掘新的杀虫晶体蛋白,以扩展杀虫谱范围并增加杀虫效果。随着实验技术的改进,每年新发现的杀虫蛋白基因数目迅速增长,据统计目前已报道的基因已经超过了700多种。新基因的发掘为新Bt杀虫剂的开发以及抗虫转基因植物提供了基因资源。
本文通过生物测定,从实验室保存的388株苏云金芽胞杆菌中筛选出了28株对蚊幼虫有毒性的菌株。通过设计10大类基因cry1、cry2、cry4、cry11、cry30、cry32、cry48、cry49、cyt1和cyt2的简并引物,对筛选出的有毒菌株进行相关基因的检测,其中19株菌中检测出了cry1类基因,17株菌检测出了cry2类基因,另外检测出cry4类基因,cry11类基因,cyt1类基因,以及cyt2类基因的菌株均为4株。测序分析发现,90%以上的基因都与已经报道的基因有95%以上的相似性,而从Bt HD521菌株中扩增获得的基因片段与已报道的基因仅有67%的一致性,分析其可能为一个新的杀虫基因。通过Genome walking技术,从Bt HD521中获得了6.7 kb的DNA片段。序列分析表明该DNA片段含有一个3,177 bp的ORF,与已经报道的杀虫晶体蛋白Cry7Fa具有76%的一致性,其上游有一个405 bp的ORF,与已经报道的P19伴侣蛋白具有47%的一致性。采用自身和外源启动子进行了两个蛋白基因的表达、纯化和特性分析。结果表明,3,177 bp的ORF能在在大肠杆菌中和苏云金芽胞杆菌无晶体突变株得到了成功表达。进一步的研究表明,该基因只能利用自身启动子进行表达,而不能利用cry1 Ca、bin、 cyt1Aa等基因的启动子进行表达,说明该蛋白基因的表达具有一定的启动子特异性。电镜观察和蛋白分析表明,该蛋白大小为130 kDa左右,能在细菌芽胞期形成菱形晶体。对蚊幼虫的生物测定表明,重组表达蛋白对蚊幼虫、棉铃虫和甜菜夜蛾无明显的毒杀作用。同时发现p15基因可在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株中表达,具有同P20伴侣蛋白相同的功能,可以使Cyt1Aa蛋白在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株中大量表达形成晶体。通过敲除掉p15基因和保留p15基因发现,P15蛋白缺失并不影响晶体的形状和大小,但是却影响晶体蛋白的表达量,P15辅助蛋白的存在能显著增强晶体蛋白表达。根据目前存在的新基因新颖性命名方法,3,177 bp的ORF编码一个二类新基因,暂命名为cry7La(1),而其上游的405 bp的ORF编码一个新的伴侣蛋白,命名为p15。本研究鉴定了一个一个新的二类杀虫基因和一个新的辅助蛋白基因p15,丰富了苏云金芽胞杆菌杀虫基因资源库,为杀虫菌株的遗传改良和转基因生物的构建提供了基因资源。