肿瘤微环境中肿瘤细胞和免疫细胞之间的相互作用促进肿瘤免疫逃逸或炎症反应。近年来我们课题组证实,在肿瘤微环境中存在一种新型的LC-3II阳性的细胞外囊泡（LC-3II⁺Extracellular Vesicles,LC-3II⁺EVs）,主要来源于肿瘤细胞释放的分泌型自噬小体,我们将其命名为肿瘤细胞释放自噬小体（tumor cell released autophagosome,TRAP）。后续研究发现TRAPs携带的损伤相关的分子模式（damage associated molecular patterns,DAMPs）可以诱导B细胞、单核/巨噬细胞和中性粒细胞成为具有免疫抑制功能的IL-10⁺Breg细胞、PD-L1^highIL-10⁺M2型巨噬细胞和产生大量ROS的中性粒细胞。CD4⁺T细胞是机体重要的抗肿瘤免疫细胞之一,目前关于CD4⁺T细胞亚群在肿瘤微环境中的分化机制及其免疫调节功能尚不完全清楚。因此本论文主要探讨TRAPs是否参与CD4⁺T细胞的分化和免疫调节,值得深入研究。目的:探讨TRAPs诱导CD4⁺T细胞分化及其免疫调节功能的机制研究,旨在阐明肿瘤微环境中―TRAPs—CD4⁺T细胞—肿瘤免疫微环境‖之间的免疫调控网络,为后期肿瘤免疫治疗提供新的靶点或治疗思路。方法:1.肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）体内外诱导CD4⁺T细胞分化的研究分选出WT小鼠脾细胞来源的CD4⁺T细胞,体外在αCD3/CD28培养条件下加入不同浓度的TRAPs分别诱导培养24 h或72 h后,收获细胞和培养上清,采用qRT-PCR和流式细胞术检测CD4⁺T细胞各亚群标志分子表达变化;ELISA检测培养上清中细胞因子的变化。C57BL/6小鼠尾静脉注射TRAPs或皮下注射B16F10细胞构建荷瘤小鼠,流式细胞术检测各组小鼠脾脏和淋巴结中IL-6⁺CD4⁺T、IL-10⁺CD4⁺T和IL-21⁺CD4⁺T细胞的比例变化。2.TRAPs诱导CD4⁺T细胞分化的分子机制研究分选WT小鼠脾细胞来源的CD4⁺T细胞,体外在αCD3/CD28培养条件下加入不同浓度的CFSE标记的TRAPs共孵育24 h后,激光共聚焦荧光显微镜观察CFSE标记的TRAPs与PE标记的CD4⁺T细胞或PE标记的TLR2的相互作用;流式细胞术检测CFSE-TRAP⁺CD4⁺T细胞比例。分选出WT、TLR2^-/-、TLR4^-/-、MyD88^-/-和IL-6^-/-CD4⁺T细胞,加入TRAPs（3μg/ml）诱导培养72 h后,ELISA检测培养上清中IL-6、IL-10和IL-21的浓度;分选WT CD4⁺T细胞,加入TRAPs（3μg/ml）诱导不同的时间,或用信号分子抑制剂或IL-6中和抗体等预处理1 h,Western Blot检测MAPKs信号通路中（JNK、ERK和p38）、NF-κB通路中（IKKα/β、IκBα和p65）、Akt或STAT3及其磷酸化水平;qRT-PCR和ELISA法检测CD4⁺T细胞IL-6、IL-21和IL-10的表达变化。将WT和IL-6^-/-小鼠分别尾静脉注射TRAPs,检测脾脏和淋巴结中IL-21⁺CD4⁺T细胞和IL-10⁺CD4⁺T细胞比例变化。分选小鼠脾细胞来源的或人PBMCs中来源的CD4⁺T细胞,体外在αCD3/CD28培养条件下加入小鼠或人肿瘤细胞来源的TRAPs或预处理的TRAPs（超声破碎、蛋白酶K消化、抗体封闭或CFSE染色）分别诱导相应的时间后,分别检测CD4⁺T细胞中信号分子活化情况、IL-6表达和分泌水平。3.TRAPs诱导的CD4⁺T细胞(T_TRAP)免疫调节功能的研究3.1 T_TRAP细胞调节T细胞应答及其对肿瘤生长和转移的研究分选WT小鼠脾细胞来源的T细胞,在αCD3/CD28培养条件下,分别加入30%体积的正常培养CD4⁺T细胞上清（SN/CD4⁺T）和TRAPs诱导的CD4⁺T细胞上清(SN/T_TRAP)或用IL-6、IL-10和IL-21中和抗体预处理的SN/T_TRAP,培养72 h后,FACS检测IFN-γ⁺CD4⁺T和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞比例。皮下免疫DC/OVA疫苗建立OVA特异性T细胞应答的小鼠模型或在免疫前过继转移OT-I小鼠脾细胞,免疫间隙过继转移CD4⁺T或TRAP诱导的CD4⁺T细胞,在末次免疫后第7天,收获各组小鼠的脾脏细胞,流式细胞术检测OT-I T细胞的比例及数量;或用OVA蛋白再刺激24 h,测脾细胞中IFN-γ⁺CD4⁺T细胞和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的比例。WT C57BL/6小鼠皮下或尾静脉注射B16F10细胞构建皮下和肺转移瘤模型,同时注射正常培养的WT CD4⁺T细胞和TRAPs诱导的WT CD4⁺T细胞或IL-6^-/-CD4⁺T细胞,观察皮下肿瘤大小和肺组织上肿瘤结节数量及大小。3.2 T_TRAP细胞调节B细胞分化及其对肿瘤生长和转移的研究WT C57BL/6小鼠尾静脉注射TRAPs诱导的CD4⁺T细胞,流式细胞术检测脾细胞中IL-10⁺B细胞的比例和数量。分选脾细胞来源的B细胞,单独或联合加入TRAPs、CD4⁺T细胞、SN/CD4⁺T、SN/T_TRAP或分别用αIL-6、αIL-10和αIL-21预处理的SN/T_TRAP培养72h后,检测各组IL-10⁺B细胞比例和IL-10的浓度。皮下免疫DC/OVA疫苗,建立OVA特异性T细胞应答小鼠模型或者在免疫前过继转移OT-I小鼠脾细胞,免疫间隙过继转移不同条件诱导的B细胞3次,在末次免疫后第7天,收获各组小鼠的脾脏细胞,采用流式细胞术检测OT-I T细胞的比例及数量;或用OVA蛋白再刺激24 h,流式细胞术检测脾细胞中IFN-γ⁺CD4⁺T细胞和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的比例。WT C57BL/6小鼠皮下或尾静脉注射B16F10细胞构建皮下和肺转移瘤模型,同时注射不同条件诱导的B细胞,观察皮下肿瘤大小和肺组织上肿瘤结节数量及大小。3.3体内抑制TRAP或Il6对CD4⁺T细胞和B细胞分化及肿瘤生长的研究利用慢病毒敲低自噬相关基因Becn1,构建自噬缺陷B16F10小鼠黑色素瘤细胞株,收集相同Becn1 KD和Becn1 NC B16F10细胞数量来源的培养上清,采用Western blot检测上清中TRAPs的含量;ELISA检测两组上清体外诱导CD4⁺T细胞分泌IL-6、IL-10和IL-21的量。Becn1 KD和Becn1 NC B16F10细胞皮下构建荷瘤小鼠,观察两组细胞体内生长速度差异;流式细胞术检测两组荷瘤小鼠肿瘤组织和淋巴结中IL-10⁺CD4⁺T细胞、IL-21⁺CD4⁺T细胞、IFN-γ⁺CD4⁺T细胞和IL-10⁺B比例变化;ELISA检测外周血中IL-6含量。将WT和IL-6^-/-小鼠皮下接种B16F10细胞生长至第21 d后,测量肿瘤体积大小;流式细胞术检测各组小鼠淋巴结和肿瘤组织中IL-10⁺CD4⁺T细胞、IL-21⁺CD4⁺T细胞和IL-10⁺B比例变化。结果:1.肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）体内外诱导CD4⁺T细胞分化的研究体外检测结果显示,TRAPs可以显著诱导CD4⁺T细胞高表达Il6和Il21,同时Il10和Il17的表达也有一定比例的升高,其它基因Il1b、Il2、Il4、Il8、Il9、Il22.、Ifng、Tnf、Tgfb1和Foxp3 mRNA表达变化不明显;与mRNA表达水平一致,TRAPs处理组IL-6、IL-10和IL-21的分泌量及IL-6⁺CD4⁺T、IL-10⁺CD4⁺T和IL-21⁺CD4⁺T细胞比例显著高于对照组,同时IL-21⁺CD4⁺T细胞表达Tfh细胞表型CXCR5和特异性转录因子Bcl6。与之相反,TRAPs处理组中IFN-γ⁺CD4⁺T细胞的比例显著降低,另外还发现TRAPs体外可以抑制IL-12诱导的CD4⁺T细胞向Th1细胞方向极化。体内检测结果显示,与荷瘤小鼠体内结果一致,TRAPs体内也可以诱导小鼠脾脏和淋巴结中IL-6⁺CD4⁺T、IL-10⁺CD4⁺T和IL-21⁺CD4⁺T细胞的比例的增高。以上结果证实TRAPs在体内外可以诱导CD4⁺T细胞分泌IL-6、IL-10和IL-21。2.TRAPs诱导CD4⁺T细胞分化的分子机制研究首先,TRAPs不能被CD4⁺T细胞所摄取而是结合于细胞表面发挥功能;TRAPs诱导WT和TLR4^–/–CD4⁺T细胞分泌IL-6、IL-10和IL-21的水平显著增加,而在TLR2^–/–和MyD88^–/–CD4⁺T细胞中IL-6、IL-10和IL-21的分泌量变化不明显;激光共聚焦显微镜检测结果显示TRAPs与CD4⁺T细胞表面的TLR2受体共定位,提示TRAPs通过TLR2-MyD88信号通路诱导CD4⁺T细胞分泌IL-6、IL-10和IL-21。随后,Western blot检测结果显示,TRAPs处理30-120min范围内CD4⁺T细胞中IKKα/β、I-kBα、p65、Akt、p38和STAT3的磷酸化水平显著增加,而ERK1/2和JNK1/2的磷酸化水平变化不明显,提示TRAPs可以活化CD4⁺T细胞中NF-κB、PI3K/Akt、p38和STAT3信号通路。当用相关抑制剂预处理后,NF-κB抑制剂Bay11-7082、PI3K抑制剂LY294002和p38抑制剂SB203580可以显著抑制IL-6,IL-10和IL-21的分泌,特别是Bay11-7082;而ERK抑制剂PD98059和JNK抑制剂SP600125对IL-6,IL-10和IL-21分泌均没有影响;STAT3抑制剂static可以显著抑制TRAPs诱导CD4⁺T细胞中STAT3的磷酸化水平及其IL-10和IL-21的分泌,而IL-6的分泌不受影响,说明TRAPs通过NF-κB、PI3K/Akt和p38信号通路诱导CD4⁺T细胞分泌IL-6,IL-10和IL-21,而IL-10和IL-21的分泌又受到STAT3进一步调控。最后体外检测发现,IL-6中和抗体可以显著抑制TRAPs诱导CD4⁺T细胞STAT3的磷酸化和IL-10和IL-21的分泌;同时,STAT3磷酸化、IL-10和IL-21表达和分泌在TRAPs诱导IL-6^–/–CD4⁺T细胞中不发生明显变化;与体外结果一致,TRAPs体内诱导IL-6^–/–C57BL/6小鼠淋巴结和脾脏细胞中IL-21⁺CD4⁺T细胞和IL-10⁺CD4⁺T细胞的比例显著低于WT C57BL/6小鼠组。以上结果说明,TRAPs体内外通过TLR2-MyD88-NF-κB信号通路诱导CD4⁺T细胞分泌IL-6,然后自分泌的IL-6再通过IL-6/STAT3通路进一步诱导IL-10和IL-21的分泌。B16F10、EL4、Hepa1-6和LLC细胞来源的TRAPs体外均可以诱导CD4⁺T细胞表达和分泌IL-6。用超声破碎或蛋白酶K消化后的TRAPs诱导CD4⁺T细胞表达和分泌IL-6的量显著降低,提示TRAPs主要是通过膜表面蛋白而非内容物发挥功能。当TRAPs分别用HSP60、HSP70、HSP90α和HMGB1封闭抗体封闭后,仅有HSP90α封闭抗体可以显著抑制TRAPs与CD4⁺T细胞的结合、胞内信号通路的活化以及IL-6的表达和分泌,提示TRAPs膜表面上HSP90α是诱导CD4⁺T细胞表达和分泌IL-6的功能分子。与小鼠肿瘤细胞来源的TRAPs结果相一致,临床肿瘤患者癌性胸/腹水或人肿瘤细胞（A375、MDA-MB-231和HepG2）来源的hTRAPs也可以显著诱导人外周血来源CD4⁺T细胞表达和分泌IL-6,当hTRAPs经HSP90α封闭抗体预处理后,CD4⁺T细胞表达和分泌IL-6的量也显著降低。以上结果说明,HSP90α是小鼠和人肿瘤细胞来源TRAPs诱导CD4⁺T细胞分泌IL-6的关键膜分子。3.TRAPs诱导的CD4⁺T细胞(T_TRAP)免疫调节功能的研究3.1 T_TRAP细胞调节T细胞应答及其对肿瘤生长和转移的研究T细胞功能实验结果显示:与对照组和正常培养的CD4⁺T细胞培养上清（SN/CD4⁺T）组相比,TRAPs诱导的CD4⁺T细胞培养上清(SN/T_TRAP)可显著抑制体外αCD3/αCD28单抗刺激的CD4⁺T和CD8⁺T细胞IFN-γ的分泌;同时,TRAPs诱导的CD4⁺T细胞(T_TRAP)体内也可以显著抑制DC/OVA诱导的OT-I T细胞的增殖以及IFN-γ⁺CD4⁺T细胞和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的比例,提示我们CD4⁺T细胞经TRAPs诱导后可以抑制αCD3/αCD28非特异性和DC/OVA特异性诱导T细胞的免疫应答。另外,皮下瘤和肺转移瘤模型检测结果显示,TRAPs诱导的CD4⁺T细胞体内可以促进小鼠B16F10黑色素瘤细胞的生长与肺转移。抗体中和实验显示:与SN/T_TRAP组相比,αIL-6预处理的SN/T_TRAP组IFN-γ⁺CD4⁺T细胞和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的比例显著提高,而αIL-10与处理组仅可以略微升高IFN-γ⁺CD4⁺T细胞和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的比例,当αIL-6和αIL-10两种抗体联合预处理后,IFN-γ⁺CD4⁺T细胞和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的比例可以完全恢复,说明TRAPs诱导的CD4⁺T细胞主要依赖分泌IL-6发挥T细胞功能抑制作用。与上述结果一致,TRAPs诱导的WT CD4⁺T细胞体内可以促进小鼠B16F10黑色素瘤的生长和肺肿瘤结节数目的增加,而TRAPs诱导的Il6^-/-CD4⁺T细胞体内对小鼠B16F10黑色素瘤的生长和肺肿瘤结节数目不但没有促进作用,相反还具有一定的抑制肿瘤生长和肺肿瘤结节数。以上结果提示我们TRAPs诱导CD4⁺T细胞体内主要通过分泌IL-6发挥抑制T细胞功能作用,进而促进肿瘤的生长与肺转移。3.2 T_TRAP细胞调节B细胞分化及其对肿瘤生长和转移的研究T_TRAP细胞体内可以显著诱导小鼠脾脏细胞中IL-10⁺B细胞的比例和数量的增加。体外结果显示SN/T_TRAP也可以诱导IL-10⁺B细胞比例和IL-10分泌的显著增加;同时还发现,在体外CD4⁺T细胞可以显著的提高TRAPs诱导IL-10⁺B细胞的比例,提示T_TRAP细胞和SN/T_TRAP可以促进IL-10⁺B细胞的分化,同时TRAPs和CD4⁺T细胞在诱导B细胞分化成为IL-10⁺B细胞过程中具有一定的协同作用。抗体中和实验结果显示,当SN/T_TRAP分别用αIL-6、αIL-10或αIL-21预处理后,IL-10⁺B细胞的比例均显著下降,说明SN/T_TRAP中IL-6、IL-10和IL-21是协同增强TRAPs诱导IL-10⁺B细胞分化的关键细胞因子。OVA特异性T细胞应答小鼠模型中结果显示,SN/T_TRAP联合TRAPs诱导的高比例的IL-10⁺B细胞(B_{TRAP+SN/TTRAP})体内抑制DC/OVA诱导的OT-I T细胞的增殖和OVA特异性的T细胞的能力显著高于TRAPs单独诱导的IL-10⁺B细胞(B_TRAP)。皮下瘤和肺转移瘤模型也显示,与B_TRAP细胞组相比,B_{TRAP+SN/TTRAP}细胞体内可以更显著的促进小鼠B16F10黑色素瘤细胞的生长与肺转移。以上结果进一步证实:TRAPs诱导的CD4⁺T细胞可以进一步增强TRAPs诱导Breg细胞的生成及其免疫抑制功能。3.3体内抑制TRAP或Il6对CD4⁺T细胞和B细胞分化及肿瘤生长的研究敲低自噬相关基因Becn1后,Becn1 KD B16F10细胞在饥饿条件下不仅细胞内的自噬水平低于Becn1 NC B16F10细胞,而且细胞外分泌型自噬小体TRAPs的分泌量也显著降低,同时Becn1 KD B16F10细胞体内的生长速度也显著低于Becn1 NC B16F10细胞。另外,Becn1 KD B16F10细胞荷瘤小鼠外周血中的IL-6浓度、淋巴结和肿瘤组织中IL-10⁺CD4⁺T细胞、IL-21⁺CD4⁺T细胞和IL-10⁺B细胞的比例显著低于Becn1 NC B16F10组,相反IFN-γ⁺CD4⁺T细胞的比例又显著高于Becn1 NC组。提示,靶向B16F10肿瘤细胞的自噬相关基因Becn1可以抑制体内肿瘤的生长,也可以逆转肿瘤微环境中CD4⁺T细胞和B细胞的分化。在WT和IL-6缺陷的C57BL/6小鼠构建B16F10黑色素瘤模型中,IL-6缺陷小鼠组中的肿瘤大小显著小于WT组,且IL-6缺陷小鼠淋巴结和肿瘤组织中IL-10⁺CD4⁺T细胞、IL-21⁺CD4⁺T细胞和IL-10⁺B细胞比例显著降低。推测荷瘤小鼠体内IL-6通过诱导IL-10⁺CD4⁺T细胞和IL-21⁺CD4⁺T细胞和IL-10⁺B细胞的分化发挥免疫抑制作用,进而发挥促进肿瘤生长的作用。提示,靶向肿瘤微环境中的IL-6可以逆转CD4⁺T细胞和B细胞的分化,进而机体的抗肿瘤免疫反应。结论:1.TRAPs体外可以诱导CD4⁺T细胞分泌IL-6、IL-10和IL-21,抑制CD4⁺T细胞向Th1细胞亚群分化,且TRAPs诱导获得的IL-21⁺CD4⁺T细胞表达Tfh细胞特异性转录因子Bcl-6和膜分子CXCR5。2.TRAPs膜结合型Hsp90α通过TLR2-MyD88-NF-κB信号通路诱导CD4⁺T细胞分泌IL-6,另外,p38和PI3K/Akt信号通路也参与了其中的调控。3.TRAPs诱导CD4⁺T细胞自分泌或旁分泌的IL-6又通过IL-6/STAT3通路诱导CD4⁺T细胞分泌IL-10和IL-21。4.TRAPs诱导的CD4⁺T细胞通过直接分泌IL-6和IL-10或间接诱导IL-10⁺Breg细胞发挥抑制T细胞免疫应答,最终促进肿瘤的生长与转移。5.敲低肿瘤细胞自噬相关基因Becn1或敲除小鼠体内Il6基因可以抑制肿瘤生长,也可以抑制IL-10⁺、IL-21⁺CD4⁺T细胞和IL-10⁺Breg细胞的分化。