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随着抗生素在临床上长期、广泛的使用,细菌耐药性的出现及日益严重化给临床抗感染治疗带来了严峻挑战。金黄色葡萄球菌是一种重要的条件致病菌,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)已成为全球院内感染的首要病原菌,其多重耐药菌株不断涌现,使得临床治疗变得更加困难。万古霉素曾是治疗MRSA感染的理想药物,但随着万古霉素的广泛应用,已出现一些耐万古霉素金黄色葡萄球菌的报道,因而寻找新的治疗方法十分必要。
研究表明,MRSA耐药机制包括靶位改变、钝化酶产生、主动外排等。其中,抗生素作用靶位的改变是最主要的耐药机制。通常,金葡菌细胞壁的肽聚糖合成是由一组称为青霉素结合蛋白(Penicillin-binding proteins,PBPs)的蛋白酶系完成的,PBPs有转糖基酶(glycosyltransferase,Tgase)和转肽酶(transpeptidase,Tpase)2种酶学活性,β-内酰胺类抗生素能与PBPs的转肽酶功能域(Tpase domain)选择性结合,使其乙酰化而灭活Tpase活性,阻断细菌肽聚糖合成,进而杀灭敏感菌。耐药MRSA菌则从一种未知宿主中获得了一mecA基因,编码产生一种新的PBP,称为PBP2a,其Tpase domain与β-内酰胺类抗生素的亲和力极低,当正常PBPs被β-内酰胺类药物结合而失去活性时,PBP2a能代替其功能,继续肽聚糖合成,维持金葡菌的生长和成活。也就是说,MRSA通过表达PBP2a,改变抗生素的作用靶点,参与MRSA的耐药性表达。
许多研究表明,在MRSA中,PBP2a是其高水平β-内酰胺类抗生素耐药性所必须的。然而,PBP2a如何参与MRSA的耐药性表达?有否相应的共激活或抑制分子等调节因子存在?目前都不清楚。本研究中,我们将MRSA菌PBP2a Tpase domain克隆到pRBR载体上,构建成诱饵质粒,利用细菌双杂交系统(Bacterial two-hybnd system,B2H),从MRSA基因组表达文库中筛选到了九个可能与PBP2a有相互作用的猎物多肽。随后,利用体外Pull-down实验验证了其中一个猎物多肽P2与PBP2a的相互作用。
本研究主要内容和结果包括以下两个部分:
1.利用细菌双杂交系统筛选PBP2a相互作用的蛋白:①以质粒pMD-PBP2a(含有MRSA的PBP2a Tpase domain编码序列)为模板,利用PCR扩增MRSA PBP2a蛋白的Tpase编码基因,经BamHI/XhoI双酶切,克隆入pRBR质粒载体中,转化入大肠杆菌DH5a,构建了诱饵质粒pBR-PBP2a,并进行PCR、限制性酶切和测序鉴定。②提取了MRSA基因组DNA,Sau3AI部分酶切后克隆入pRAC质粒载体中,成功构建了基因组文库。随机选取50个克隆,用位于pRAC质粒多克隆位点两侧的测序引物进行菌落PCR扩增,检测文库插入片段的分布情况。所构建的MRSA N315株基因组文库覆盖率达9倍,满足后续文库筛选的需要。③将构建正确的诱饵质粒pBR-PBP2a与基因组文库共转化KS1细胞(其为染色体上整合有由λ操纵子控制的报告基因1acZ的报告菌株),接种于含50mg/ml X-gal,100μmol/L IPTG,100μg/ml AMP,50μg/ml Kan,34μg/ml C1的琼脂平板培养后,挑取深蓝色菌落进行LacZ活性检测。同时以空质粒pRAC转化pBR-PBP2a/KS1细胞为阴性对照,以文献报道的pACλCI-βflap(克隆了沙眼衣原体RNA聚合酶β亚单位的β-flap domain)转化含pBRL28(克隆了沙眼衣原体CT663编码基因)的KS1菌为阳性对照。④通过对200个克隆的LacZ活性检测,将筛选到β-半乳糖苷酶活性明显升高的克隆用B2H进行第二次双杂交验证,LacZ确实升高2倍以上者为猎物质粒。一共获得9个猎物克隆,分别将含有插入序列的pRAC质粒分离并测序,并将9个克隆质粒命名为pAC-p1～pAC-p9。⑤将9个插入序列用BLASTI具进行序列比对,信息学分析表明它们均来自于MRSA N315基因组,插入片段最长者649 bp,最短者335bp,9个插入片段中含14个编码基因,其中10个功能未知,1个编码二氢吡啶二羧酸合酶、1个编码二氢吡啶二羧酸还原酶,2个编码染色体解离SMC蛋白。9个克隆中介导与PBP2a相互作用的多肽由14-46氨基酸组成。
2.PBP2a与猎物多肽相互作用的再验证:为证实B2H筛选到的猎物质粒所编码的蛋白与PBP2a Tpase domain确实存在相互作用,我们进行了猎物融合蛋白的表达、纯化以及体外Pull-down PBP2a的实验,具体包括①根据B2H检测中β-半乳糖苷酶活性升高程度以及测序结果分析,选择了pAC-p2质粒中的插入片段进行深入探讨。设计并合成一对引物,以质粒pAC-p2为模板,PCR扩增了插入的p2序列,克隆入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建了pGEX-p2重组质粒,转化大肠杆菌BL21感受态。②对pGEX-p2/BL21重组菌进行诱导,表达目标融合蛋白,并对表达条件进行摸索,得到最适表达条件。③大量表达融合蛋白,利用GST-Sepharose4B免疫亲和纯化GST-多肽融合蛋白,得到可溶的纯度较高的GST-多肽融合蛋白。同时对含GST基因的pGEX-6p-1空载体进行诱导表达,纯化获得GST蛋白,作为对照。④将GST融合蛋白固化在GST-Sepharose4B树脂上,充当诱饵蛋白,通过蛋白间相互作用,捕获了PBP2-2a蛋白(含有PBP2分子绞链区N-端与PBP2a分子Tpase domain的嵌合蛋白),用Western blot鉴定了该多肽与PBP2a蛋白质间存在相互作用。
综上所述,本研究设计并利用细菌双杂交技术从MRSA基因组文库中成功筛选到与PBP2a相互作用的多肽,并成功克隆表达纯化该多肽的融合蛋白,利用体外Pull-down实验验证了两者的相互作用,为下一步研究该多肽对PBP2a活性的影响,深入认识PBP2a介导MRSA耐药性发生机理奠定了坚实的基础。