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胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤,由于大多数胶质瘤呈浸润性生长且与周围脑组织边界不清,运用现代显微外科技术、放疗、化疗等综合治疗措施后胶质瘤患者预后依然不理想。阐述胶质瘤发生、发展的分子机制,寻找特异性诊断和治疗靶标是目前胶质瘤基础研究的重点。
原癌基因的激活和抑癌基因的失活可以导致肿瘤的发生和发展,尤其是许多激酶类的原癌基因的激活因为在人类肿瘤中起着必需的作用而引起广泛关注。IKBKE和ILK均属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族的一员,其功能和作用机制尚未完全不清楚。目前尚未有IKBKE和ILK在星形细胞瘤方面的研究报道。
第一部分、IKBKE和ILK在人脑星形细胞瘤中的表达
方法:1)采用Real time RT-PCR、western blot和免疫细胞化学方法检测IKBKE和ILK在正常人星形胶质细胞及人星形细胞瘤细胞系中的表达。2)收集4对临床星形细胞瘤及肿瘤周边正常脑组织,提取总蛋白和mRNA,采用Realtime RT-PCR和western blot方法检测IKBKE和ILK的表达。3)对71例临床星形细胞瘤和10例正常人脑组织石蜡标本行SP免疫组织化学染色,检测IKBKE蛋白表达情况。应用SPSS10.0进行相关统计学分析(P<0.01)。4)对228例临床星形细胞瘤和10例正常人脑组织石蜡标本行SP免疫组织化学染色,检测ILK蛋白表达情况。应用SPSS10.0进行相关统计学分析(P<0.01)。
结果:1)人星形细胞瘤细胞系中IKBKE和ILK mRNA和蛋白高表达,而在正常人星形细胞中IKBKE和ILK mRNA和蛋白低表达。免疫细胞化学显示IKBKE在正常人星形细胞中无明显表达,在星形细胞瘤细胞系中呈强阳性表达。2)人星形细胞瘤组织IKBKE和ILK mRNA和蛋白高表达,而在其对应的瘤旁组织中IKBKE和ILKmRNA和蛋白低表达。3)免疫组化结果表明在星形细胞瘤组织中IKBKE定位于细胞浆,IKBKE在星形细胞瘤组织中高表达并在正常脑组织中低表达或不表达,星形细胞瘤标本中平均光密度值明显高于正常脑组织标本(p<0.01);Spearman相关性分析显示IKBKE的高表达与星形细胞瘤的病理分级无显著性相关。4)免疫组化结果表明ILK在星形细胞瘤组织中高表达并在正常脑组织中低表达,ILK高表达与星形细胞瘤的病理分级正相关,随着ILK表达的增强,总体生存曲线有逐渐下降的趋势。
结论:
1.正常人星形细胞中IKBKE和ILKmRNA和蛋白低表达,人星形细胞瘤细胞系中IKBKE的mRNA和蛋白均有不同程度的高表达;
2.人星形细胞瘤组织中IKBKE和ILK mRNA和蛋白表达水平均比瘤旁组织升高;
3.IKBKE蛋白在正常脑组织中低表达或不表达,不同级别的星形细胞瘤IKBKE表达均显著高于正常脑组织。IKBKE高表达与星形细胞瘤临床分级二者之间无显著性相关。
4.ILK蛋白在正常脑组织中低表达或不表达,不同级别的星形细胞瘤ILK表达均显著高于正常脑组织。ILK高表达与星形细胞瘤临床分级二者之间呈显著性正相关,与患者的生存率负相关。
第二部分、IKBKE异常表达对星形细胞瘤细胞凋亡的影响
正常细胞的增殖、分化、凋亡受到一序列复杂基因群的严格调控,胶质瘤疗效不佳主要与下列因素有关:细胞增殖失控、细胞抵抗凋亡、丰富的血管生成等,其中细胞增殖/凋亡的失衡可能是胶质瘤发生和难治的重要机制。研究表明抑制宫颈癌Hela细胞和有IKBKE扩增的乳腺癌细胞系IKBKE的表达可诱导细胞凋亡。本部分旨在探讨IKBKE表达上调和下调后对星形细胞瘤细胞凋亡的影响。
方法:1)采用逆转录病毒感染的方法将pBabe-Puro-Flag和pBabe-Puro-Flag-IKBKE分别转染人星形细胞瘤细胞系U87MG和LN-18,经嘌呤霉素筛选,连续传代,收集和抽提第5代细胞的总RNA和蛋白,经定量Real time RT-PCR和Western Blot检测IKBKE的表达。2)构建3种pSUPER.retro.puro/IKBKERNAi,继采用逆转录病毒感染的方法将3种pSUPER.retro.puro/IKBKE RNAi和pSUPER.retro.puro分别转染人星形细胞瘤细胞系U87MG和LN-18,经嘌呤霉素筛选,连续传代,收集和抽提第5代细胞的总mRNA和蛋白,real timeRT-PCR和western blot检测IKBKE的表达。3)adriamycin(0.1μM)诱导后Annexin V-FITC/PI双标记法检测稳定转染细胞系的凋亡;UV(40J/m2)诱导后TUNEL法检测稳定转染细胞系的凋亡;不同剂量的UV和不同浓度的adriamycin处理稳定转染细胞系,通过活细胞计数、检测Bcl-2和caspase-3变化以确定IKBKE对星形细胞瘤细胞凋亡的影响。
结果:1) U87MG/pBabe-Puro-Flag-IKBKE和LN-18/pBabe-Puro-Flag-IKBKE细胞中IKBKE的表达在转录和翻译水平均明显高于对照组细胞U87MG和LN-18空载体。2)U87MG/pSUPER.retro.puro/RNAi和LN-18/pSUPER。retro.puro/RNAi细胞中IKBKE的表达量在转录和翻译水平均低于空载体对照组,其中LN-18/pSUPER.retro.puro[RNAil和LN-18/pSUPER.retro.puro/RNAi3细胞中IKBKE的表达量下降更明显,U87MG/pSUPER.retro. puro/RNAi3细胞中IKBKE的表达量下降更明显,随后的现象和作用机制的研究以这些稳定转染细胞系为研究对象。3)LN-18和U87MG/pBabe- Puro-Flag-IKBKE星形细胞瘤细胞系与空载体Annexin V-FITC/PI双标记和TUNEL法结果对比显示,后者细胞凋亡比例较高。
结论:
1.成功建立外源性IKBKE高表达的人星形细胞瘤细胞系U87MG和LN-18pBabe-Puro-Flag-IKBKE。
2.成功构建了IKBKE RNAi稳定转染人星形细胞瘤细胞系U87MG和LN-18pSUPER.retro.puro/RNAi。
3.IKBKE表达上调后U87MG和LN-18稳定转染细胞系抗凋亡能力增强,IKBKE表达下调后U87MG和LN-18稳定转染细胞系抗凋亡能力减弱。
4.IKBKE表达下调后U87MG和LN-18稳定转染细胞系激活的Caspase-3增多,Bcl-2减少,细胞凋亡增多;IKBKE表达上调后激活的Caspase-3减少,Bcl-2增多,细胞凋亡减少。
第三部分、IKBKE异常表达对星形细胞瘤细胞凋亡影响作用机制的研究
IKK(IkB kinase)家族属于丝氨酸/苏氨酸激酶,可以磷酸化IkB,从而激活NF-kB通路,促进NF-kB核移位。那么IKBKE作为IKK家族成员之一,其在星形细胞瘤中是否可以通过激活NF-kB通路的发挥抗凋亡作用?不同IKK家族成员可以作用于不同IkB家族成员,而后者决定了NF-kB激活后哪个/些家族成员发生核移位。IKBKE是否可以促进某个NF-kB家族成员发生核移位亦是本部分将探讨的内容。
方法:1)在稳定转染细胞系中通过脂质体瞬时转染NF-kB报告基因质粒和pRL-TK,24h后检测萤火虫荧光素酶活性,所有的荧光素酶活性用Rellina活性正态化得到相对荧光素值,从而了解NF-kB启动子的活性。2)在IKBKE表达上调的稳定转染细胞系中通过脂质体瞬时转染NF-kB报告基因质粒和突变型IKBα质粒,检测萤火虫荧光素酶活性,所有的荧光素酶活性用Rellina活性正态化得到相对荧光素值,从而了解NF-kB启动子的活性。3)稳定转染细胞系NF-kB家族成员之一--p50免疫荧光染色,观察p50在细胞核和细胞浆的分布。4)提取稳定转染细胞系的细胞浆和细胞核蛋白后用western blot法检测p50的定位。
结果:1)在稳定转染细胞系中通过脂质体瞬时转染NF-kB报告基因质粒后显示IKBKE表达上调的细胞系内蛋白裂解物的相对荧光素值明显高于其空载体对照组,IKBKE表达下调的细胞内蛋白裂解物的相对荧光素值显著低于其空载体对照组。2)脂质体瞬时转染NF-kB报告基因质粒和突变型IKBα基因质粒后显示IKBKE表达上调的稳定转染细胞系相对荧光素值显著低于其空载体对照组。3)空载体稳定转染细胞系细胞核和细胞浆均可见p50荧光染色,IKBKE表达上调的稳定转染细胞系细胞核p50荧光染色明显增强,细胞浆p50荧光染色减弱,IKBKE表达下调的稳定转染细胞系细胞核p50荧光染色显著减弱。4)IKBKE表达上调的稳定转染细胞系细胞核p50蛋白增多,细胞浆p50蛋白减少,IKBKE表达下调的稳定转染细胞系细胞核p50蛋白减少,细胞浆p50蛋白增多。
结论:
1.人星形细胞瘤细胞中IKBKE可通过磷酸化Ikα激活NF-kB通路。
2.IKBKE可促进NF-kB家族成员p50发生核移位,作用于其靶基因(如Bcl-2)从而发挥其抗星形细胞瘤细胞凋亡的作用。