甘蓝型油菜WOX基因的鉴定及BnWOX45基因的功能初探

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根系(Roots)是植株吸收水分、矿物质养分及固定植株的重要器官,其发育依赖于根尖分生组织(Root apical meristem,RAM)细胞的分裂与分化。甘蓝型油菜(Brassica napus)是我国主要的油料作物,其根系不发达、主根入土较浅、易发生根倒,不利于生产。WOX(WUSCHEL-related homeobox)是植物特有的一类转录因子,参与植物生长、根系发育和胁迫响应等过程。因此,鉴定甘蓝型油菜基因组中的WOX基因,筛选其中调控(Primary root apical meristem,PRAM)发育的候选基因,并研究其分子作用机制,为油菜抗根倒株型分子育种提供新策略。本研究首先利用生物信息学的方法在全基因组水平对甘蓝型油菜中的WOX基因家族成员进行鉴定(BnWOXs),并对候选基因的系统发育关系、基因结构特征、基因扩增机制、蛋白互作网络等进行系统分析。基于油菜不同生育期的RNA-Seq数据(50个样品)、五种不同激素处理的根系RNA-Seq数据和q RT-PCR技术解析候选基因的表达特性。结合生物信息学和表达谱分析结果,筛选了其中调控PRAM发育的At WOX5的同源基因BnWOX45,并将该基因在拟南芥和油菜中分别进行过表达,初步证明了其对油菜PRAM具有调控作用。本研究取得的主要结果如下:1.甘蓝型油菜WOX基因家族的全基因组分析及其中调控根系发育基因的筛选本研究在甘蓝型油菜基因组中共鉴定了58个典型的WOX基因,分别命名为BnWOX01~BnWOX58(简称BnWOXs),系统发育分析将他们划分为3个进化分支:古老支(ancient clade)、中间支(intermediate clade)和现代支(modern clade)。其中,中间支和现代支分别被进一步划分为7个和2个亚分支。58个BnWOXs基因不均匀地分布在油菜的18条染色体上(Chr C06不含BnWOX基因)。基因结构分析表明,每个进化分支或亚分支的同源基因内含子插入模式高度保守,在候选BnWOXs蛋白中预测11个分支或亚分支特异的保守氨基酸基序(Motif)。共线性分析结果表明,异源加倍和染色体片段复制是WOX基因家族在油菜中大量扩增的主要方式。互作蛋白分析预测到了463对互作蛋白,主要为信号肽和转录因子。时空表达谱分析表明,BnWOXs基因在多个组织或器官中广泛表达,并且每个分支或亚分支内同源基因的表达谱高度相似。根系激素诱导表达谱分析表明,约50%的BnWOXs基因受激素的诱导上调或下调表达。q RT-PCR分析结果表明,现代支的WOX4亚分支的同源基因可能参与根中激素诱导、Na Cl和干旱胁迫过程。2.BnWOX45基因的克隆与功能初探基于甘蓝型油菜WOX基因家族的全基因组分析,筛选了其中调控PRAM发育的At WOX5的直系同源基因BnWOX45。q RT-PCR证明BnWOX45在油菜根尖高表达。克隆了BnWOX45的CDS序列,并构建了BnWOX45的植物过表达载体(35S启动子),并且分别转化了野生型油菜(Wester)和拟南芥(Col0)。成功获得了23株T0代转基因油菜植株和5个拟南芥阳性转基因T3代株系。转基因拟南芥T3代阳性株系表型分析表明,转基因拟南芥与野生型拟南芥(对照)相比,根尖变长;PRAM内的QC(Quient centre)细胞和周围柱干细胞分裂异常;根尖柱干细胞内淀粉粒含量明显减少。同时,我们还克隆了BnWOX45基因的启动子序列(1500bp),构建了该启动子驱动GUS报告基因的融合表达载体,并转化了野生型拟南芥(Col0),目前已获得了T1代转基因株系。
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