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氧气及其葡萄糖持续供应是保障大脑活力和功能发挥的基础。低氧引起组织、细胞功能和代谢障碍,也与众多肿瘤发生直接相关。低氧预适应(Hypoxia preconditioning,HPC)是机体为了适应低氧状态,在有限时间内积极调动内源性保护机制,激活氧感受器/信号转导通路,调控下游靶基因转录及表达以提高低氧耐受性的生物应激现象。Pre-m RNA可变剪接与转录紧密偶联,是生物功能复杂性和蛋白质组多样性的重要原因。神经系统中存在大量特异性可变剪接事件,直接影响神经系统细胞特异性分化、疾病发生等。低氧胁迫pre-m RNA可变剪接已有相关研究的报道,但大多数工作主要围绕各种肿瘤低氧微环境对机体的损伤。基于二代转录组学数据研究HPC对脑组织的保护机制还很少见。因此,本文基于小鼠低氧预适应(Whole-body hypoxic preconditioning,WHPC)动物模型和细胞模型,结合高通量转录组测序技术、生物信息学分析及分子生物学实验方法,鉴定若干调控HPC关键基因和差异可变剪接事件,从转录组水平,乃至上游代谢和信号传导通路层面上理解小鼠在低氧胁迫下预适应保护机制,为实体瘤、血管性疾病等相关疾病临床治疗方案提供有益帮助。主要研究内容及结果如下:(1)建立小鼠WHPC动物模型。利用HE染色组织形态学观察、氧化应激指标、HIF-1α和HO-1 m RNA及蛋白质表达水平定量评估小鼠WHPC动物模型。研究发现在建模过程中,随着小鼠低氧预处理次数增加,小鼠耐低氧时间也逐渐延长。HE染色显微观察发现,小鼠海马CA1区锥体细胞排列由散乱稀疏逐渐恢复正常,细胞水肿、空泡样改变呈恢复趋势。低氧预处理一次、两次和三次样本组(H1组、H2组和H3组)SOD活力、MDA表达水平显著上调;低氧预处理四次(H4组)相对于H3组,SOD活力、MDA表达水平降低。HIF-1α和HO-1m RNA及蛋白质表达水平在H4组显著升高。综上所述,此模型能较好地反映低氧预处理对小鼠海马组织产生了预适应,为后续实验奠定坚实基础。(2)分析低氧预处理小鼠海马组织差异表达基因。在建立小鼠WHPC动物模型的基础上,选择H0组(未做低氧预处理的对照组)、H1组和H4组进行了转录组测序。利用生物信息学方法对数据进行质控分析。利用edge R及DESeq2等软件对不同低氧预处理组的差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)进行筛选,并对筛选的DEGs进行GO和KEGG富集分析。使用q RT-PCR技术对13个关键DEGs进行了实验验证。GO富集分析显示,DEGs主要参与调控应激反应、细胞能量代谢、抗炎症反应、血管生成等方面。KEGG富集分析显示,DEGs主要参与调控胆碱能突触、趋化因子信号通路、细胞因子受体相互作用、TNF、MAPK等多条信号通路。(3)分析低氧预处理小鼠海马组织差异可变剪接事件。采用Hisat2和STAR软件将RNA-Seq测序得到的质控数据与小鼠基因组进行序列比对,使用r MATS软件分析了H0组、H1组和H4组差异可变剪接事件,采用半定量RT-PCR验证了Edrf1、Lrrc45、Rbm41和ptk2差异可变剪接基因(Differential alternative splicing genes,DASGs)。GO富集分析显示,DASGs主要参与调控RNA剪接、RNA聚合酶II转录、组蛋白H3去乙酰化等生物学过程。KEGG富集分析显示,DASGs涉及糖代谢、谷氨酰胺代谢、免疫调节、生理节律的调节等相关信号通路。半定量RT-PCR检测结果显示,除Rbm41外显子保留率没有显著差异外,不同低氧预处理促进了Edrf1、Lrrc45和ptk2外显子跳跃。(4)为进一步理解小鼠在低氧胁迫下适应性保护机制,我们建立了HPC小鼠HT22细胞模型。通过细胞存活率、LDH漏出率和氧化应激指标评估了HT22细胞模型。并在此基础上验证了7个DEGs(Hbb-bt、Nr4a1、Cyr61、Txnip、Dusp、Ddit4、Glut1)表达情况和5个DASGs(TUBD、Ndrg2、PLOD2、Edrf1、Lrrc45)的外显子保留率。结果表明:与H0组相比,H1组HT22细胞系存活率降低,LDH漏出率升高,SOD活力、MDA水平升高;H4组HT22细胞系存活率显著上升,LDH漏出率降低,SOD活力、MDA水平降低。DEGs验证结果显示,H1与H0组间比较,DEGs相对表达量整体趋势明显升高。H4与H1组间比较,Txnip相对表达量没有显著差异,Cyr61、Hbb-bt、Nr4a1、Dusp和Glut1相对表达量显著升高。DASGs验证结果显示,H1与H0组间比较,TUBD和PLOD2外显子保留率没有显著差异,低氧预处理促进Ndrg2、Edrf1和Lrrc45外显子跳跃。H4与H1组间比较,Lrrc45外显子保留率没有显著差异,低氧预处理促进了TUBD、Ndrg2、PLOD2和Edrf1可变外显子的跳跃。