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1研究目的通过给雄性生长期小鼠注射激活酶抑制剂后予以跑台运动干预,检测小鼠BMD、生物力学性能参数、在体骨量和骨组织形态学指标、血清尿液中骨代谢相关生物化学指标以及BMP-Smad信号通路上重要基因和蛋白含量;体外实验检测小鼠体内BMSC向成骨细胞分化的程度,无菌处理各组小鼠血清后离体细胞血清饥饿实验。初步揭示BMP-Smad通路介导跑台运动调控BMSC向成骨细胞分化的过程。2研究方法第一部分实验以18只5周龄雄性C57BL/6小鼠作为研究对象,小鼠饲养至7周龄后,按体重随机法分为对照组和运动组,每组各9只。将运动组小鼠于12跑道跑台进行为期5周的跑台运动训练,跑速为18m/min,跑台倾斜5°,每天运动时间50min,每周运动6天,共计5周。处死前8天和前1天在小鼠背部皮下注射Calcein用于对骨骼进行骨荧光标记,于处死当天称重。6只小鼠左侧股骨用于检测骨密度,6只右侧股骨用于BMD、BV/TV检测,3只左侧胫骨用于OCN mRNA和OPN mRNA检测,3只左侧胫骨用于Smad1蛋白激活情况的检测。实验结果皆以均数±标准误表示,所有数据均采用SPSS13.0软件包分析处理。采用独立样本t检验推断组间是否存在差异。P<0.05表示结果有显著性差异。第二部分实验在体动物实验将72只4周龄雄性C57BL/6小鼠饲养至6周龄,麻醉后称重并扫描小鼠全身骨密度,按体重和骨密度随机法分为4组,分别为对照组(C组)、运动组(E组)、LDN组(LDN+C组)、运动+LDN组(LDN+E组),每组18只。运动训练方案:E组和LND+E组小鼠于12跑道跑台分别进行为期6周中等强度的跑台运动训练,起始跑速为12m/min,持续时间20min,跑台倾斜度均为0°;第一周和第二周隔日跑速增加3m/min,持续时间增加10min;第三周起运动组的跑速为18m/min,运动时间50min,跑台倾斜5°。每周6天。LDN各组小鼠于第三周正式训练前予以腹腔注射ALK2激酶抑制剂(LDN—193189HCL),注射剂量为3mg/kg,每周一次。处死前8天和前1天在小鼠背部皮下注射Calcein用于对骨骼进行骨荧光标记,前1天禁食6h后采用膀胱按摩法收集小鼠尿液,于-80℃冰箱保存。小鼠于处死当天称重,小鼠血液放置1.5ml EP管中4℃过夜,于次日低温离心提取上清,上清于-80℃冰箱保存。每组3只小鼠两侧股骨和胫骨提取BMSC种于12孔板和10cm规格的培养皿中。10只小鼠左侧股骨用于检测骨密度,其中8只左侧股骨用于骨生物力学性能指标检测;6只右侧股骨用于骨组织形态计量学指标检测。4只小鼠左侧胫骨用于Real-Time PCR检测,其余左侧胫骨用于Western blot检测;3只小鼠右侧胫骨用于micro-CT。离体细胞实验部分离体实验通过CFU形成实验和ALP染色检测了小鼠BMSC向成骨细胞分化的能力以及BMSC中OCN mRNA、Osterix mRNA、Runx2 mRNA、MSX2 mRNA、DLX5mRNA的表达量。无菌处理各组小鼠血清,通过血清饥饿、Western blot检测p-Smad1、Smad1、p-P38、P38、p-ERK、ERK和Actin蛋白含量,检测运动对BMP-Smad信号通路上相关蛋白的激活和表达情况。实验数据均采用SPSS13.0软件包分析处理,论文中表格以均数±标准差表示,图以均数±标准误表示。先采用双因素方差分析,确定跑台运动、抑制剂注射是否产生独立或交互作用,针对不同因素产生的作用,再采用独立样本t检验推断组间是否存在差异。P<0.05表示结果有显著性差异。3研究结果第一部分实验结果(1)运动可以提高小鼠BMD和在体骨量:运动组小鼠股骨BMD、BV/TV均显著高于对照组(P<0.01)。(2)运动可以激活小鼠BMP-Smad信号通路:运动组小鼠胫骨OCN mRNA表达显著高于对照组(P<0.01),OPN mRNA表达高于对照组(P<0.05);运动组小鼠胫骨Smad1蛋白激活高于对照组(P<0.05)。第二部分实验结果(1)小鼠运动期间体重变化:结束为期两周的预跑后四组小鼠的体重并未出现显著性差异;正式跑步运动第一周发现LDN+C组小鼠体重显著低于C组小鼠(P<0.01),LDN+E组小鼠体重显著低于E组小鼠(P<0.01);第二周的体重趋势和第一周一样;正式跑步运动第三周LDN+C组和C组小鼠体重差异和前两周一致(P<0.01),LDN+E组小鼠体重低于E组小鼠(P<0.05);四周跑步运动结束后发现LDN+C组、LDN+E组小鼠体重均显著低于C组和E组小鼠(P<0.01)。(2)小鼠股骨BMD和骨生物力学指标结果:E组小鼠股骨BMD显著高于C组(P<0.01),LDN+E组小鼠股骨BMD高于LDN+C组(P<0.05),LDN+C组、LDN+E组小鼠股骨BMD显著低于E组(P<0.01)。股骨生物力学性能指标均未出现显著性变化。(3)小鼠股骨骨组织形态计量学结果:骨荧光结果显示E组和LDN+E组小鼠右侧股骨BV/TV高于LDN+C组小鼠(P<0.05)。E组小鼠右侧股骨Tb.N高于LDN+C组小鼠(P<0.05),LDN+E组小鼠右侧股骨Tb.N显著高于LDN+C组小鼠(P<0.01)。E组小鼠右侧股骨Tb.Sp低于LDN+C组小鼠(P<0.05),LDN+E组小鼠右侧股骨Tb.Sp显著低于LDN+C组小鼠(P<0.01)。LDN+E组小鼠右侧股骨BFR/BV低于E组小鼠(P<0.05)。C组、LDN+C组和LDN+E组小鼠右侧股骨BFR/TV均低于E组小鼠(P<0.05)。C组、LDN+E组小鼠右侧股骨BFR/BS均低于E组小鼠(P<0.05)。Masson三色染色结果显示E组小鼠右侧股骨BV/TV高于C组和LDN+C组小鼠(P<0.05)。E组小鼠右侧股骨Tb.N高于C组小鼠(P<0.05)。E组小鼠右侧股骨Tb.Sp低于C组和LDN+C组小鼠(P<0.05)。(4)小鼠胫骨皮质骨和松质骨骨量结果:E组小鼠右侧胫骨皮质骨BV/TV高于C组小鼠(P<0.05),LDN+C组小鼠右侧胫骨皮质骨BV/TV显著低于E组小鼠(P<0.01),LDN+E组小鼠右侧胫骨皮质骨BV/TV显著高于LDN+C组小鼠(P<0.01)。LDN+C组小鼠右侧胫骨皮质骨Tb.N高于E组小鼠(P<0.05)。E组小鼠右侧胫骨皮质骨Tb.Th高于C组和LDN+C组小鼠(P<0.05)。LDN+C组小鼠右侧胫骨松质骨BMD显著低于E组小鼠(P<0.05)。(5)小鼠血清、尿液指标检测结果:LDN+C组和LDN+E组小鼠血钙含量均显著高于C组和E组小鼠(P<0.01);LDN+E组小鼠血钙含量高于LDN+C组小鼠(P<0.05)。LDN+E组小鼠血磷含量显著高于C组和E组小鼠(P<0.01)。LDN+C组小鼠尿液中DPD/Ucr含量显著高于C组和E组小鼠(P<0.01);LDN+E组小鼠尿液中DPD/Ucr含量高于C组和E组小鼠(P<0.05)。E组小鼠尿液中CTX-I含量显著低于C组和LDN+C组小鼠(P<0.01),低于LDN+E组小鼠(P<0.05)。(6)小鼠胫骨内成骨细胞相关基因表达结果:LDN+C组和LDN+E组小鼠左侧胫骨内OCN mRNA的表达量比E组小鼠低(P<0.05)。(7)各组小鼠胫骨内Smad1、P38、ERK蛋白激活情况和总量的比较:C组和LDN+C组小鼠左侧胫骨内Smad1蛋白磷酸化含量均低于E组小鼠(P<0.05)。E组和LDN+E组小鼠左侧胫骨内Smad1蛋白总量均高于LDN+C组小鼠(P<0.05)。(8)小鼠BMSC中ALP染色结果以及BMSC中成骨细胞相关基因结果比较:E组小鼠BMSC向成骨细胞分化数量显著高于C组和LDN+C组小鼠(P<0.01)。LDN+C组小鼠BMSC内OCN mRNA的表达量比E组小鼠高(P<0.05);LDN+E组小鼠BMSC内OCN mRNA的表达量均比C组、E组和LDN+C组小鼠显著增高(P<0.01)。LDN+C组和LDN+E组小鼠BMSC内OCN mRNA的表达量比E组小鼠低(P<0.05)。(9)离体血清饥饿实验结果:C组、LDN+C组和LDN+E组小鼠Smad1磷酸化蛋白激活含量均低于E组小鼠(P<0.05)。4结论(1)中等强度的跑台运动通过激活Smad1磷酸化,增加小鼠体内Smad1含量,促进生长期小鼠体内BMSC向成骨细胞分化数目的增加,提高骨形成速率抑制骨吸收速率,从而达到增加小鼠骨密度和在体骨量的结果。(2)激酶抑制剂抑制雄性生长期小鼠Smad1磷酸化,降低BMSC中调节成骨细胞特异性转录因子和靶基因的表达,以及小鼠体内BMP-Smad下游成骨细胞相关基因的表达,抑制骨形成速率促进骨吸收速率,降低小鼠骨密度和体重。(3)中等强度的跑台运动能够部分拮抗激活酶抑制剂的作用,可能是通过对Smad1磷酸化和总量、BMSC中调节成骨细胞特异性转录因子和靶基因的表达、小鼠体内BMP-Smad信号通路下游成骨细胞相关基因的表达产生影响,进而影响BMSC向成骨细胞分化的数目,作用于骨吸收速率和骨形成速率,从而对小鼠在体骨量、骨密度和体重产生影响。