研究背景慢性肾脏病(CKD)在全世界越来越多,终末期肾病患者,尤其是接受透析治疗的患者死亡率与同龄正常人相比显著增加[6]。根据美国全国健康与营养评估调查(NHANES)的数据来看,在1999-2004年这段时间内美国的CKD(不包括终末期CKD)患病率已经达到13.1%,而同时段内澳大利亚、中国、印度患者按CKD分期,第3期到第5期的患病率大约为5%。慢性肾脏病患者,尤其是终末期肾病需要透析治疗或者肾移植的患者,即使移植物功能在正常范围内,其罹患心血管疾病的风险也显著增加。慢性肾功能不全患者全身炎症反应增强并通常伴随着胰岛素敏感性降低,从而导致心血管疾病的发病率和死亡率都增加。几乎所有的肾脏病都伴随着由炎症因子分泌和免疫细胞浸润引起的肾脏炎症。RAS一直是公认的全身血压和肾脏水电解质平衡的重要调节器[3],RAS的主效应器AngⅡ在高血压病血管重构中是主要介质之一。除了作为强效的血管收缩剂,AngⅡ还能通过激活氧化还原途径和转录调节诱导整合素蛋白、粘附分子、细胞因子、生长因子、促纤维化介质,引起活性氧的释放增加,并且增加NF-κB的核转位,降低内皮一氧化氮合酶(eNOS)的活性,从而起促进炎症的作用。这些促炎症效应可以被ARB阻断[10]。RAS在高血压病与心血管疾病(CVD)的发生发展和病理生理中起关键作用[4]。脂肪组织功能正常对人类健康来说是必不可少的,它作为禁食时的能量来源并为体温调节提供隔热条件,过去人们一直认为脂肪细胞只是一个不活跃的能量来源,但是最近越来越多研究表明脂肪细胞合成并分泌大量促炎症因子如细胞因子、急性期反应蛋白、趋化因子、类花生酸、前列腺素和抗炎细胞因子如脂联素、IL-10。总之,这些脂肪细胞来源的因子被称为脂肪因子。脂肪因子在过去数年里一直在增加,现在已知的由脂肪细胞分泌的脂肪因子有50多种[5]。脂肪组织由脂肪细胞(30%-50%)和前脂肪细胞、纤维母细胞、血管与免疫细胞(单核/巨噬细胞、淋巴细胞)组成。多肽类脂肪因子(如脂联素、瘦素。内脂肪素)由脂肪细胞分泌,细胞因子(MCP-1、巨噬细胞炎症蛋白、TNF-α、ILs1β、6、8、10等)由血管基质类细胞分泌,然而这两者间也有重叠,因为有的脂肪因子同时由脂肪细胞和血管基质类细胞分泌(如抵抗素和apelin)[9]。巨噬细胞浸润是慢性肾脏病和肥胖的一个共同特征,但是巨噬细胞在功能上具有明显的异质性。最近研究表明,巨噬细胞可以按功能不同分为两种不同的极性状态：M1型即“经典活化型”巨噬细胞和M2型“转化型”巨噬细胞。M1型巨噬细胞由经典的免疫途径诱导激活(如LPS和IFN-γ),并能促进炎症因子的产生,如TNF-α IL-1β、IL-6等。M2型巨噬细胞可由IL-4和IL-13刺激产生。M2型巨噬细胞通过合成抗炎细胞因子IL-10和IL-1诱导性受体及内吞清除作用在炎症消退和组织修复中起重要作用[11][12]。抑制巨噬细胞炎症因子的表达在慢性炎症模型中对肾脏损伤具有保护作用。M1型巨噬细胞与M2型巨噬细胞在体内处于动态平衡状态。长期以来,人们认为RAS仅调节着收缩压和肾脏电解质的平衡,但近十年研究发现,肾素一血管紧张素系统的多种成分也表达于多种组织中,如：肾上腺、肾脏、脑、心脏和血管中,并在各脏器局部发挥着重要作用。随着肥胖和代谢综合征的发生率增加,RAS在脂肪组织的表达和局部作用也受到了重视。大量研究已证实,人和鼠的脂肪细胞中均表达血管紧张素原(AGT)、血管紧张素转化酶(ACE)和血管紧张素受体1(AT1)和2(AT2)。简要地说,肝脏合成并释放血管紧张素原(AGT)至循环血液中,肾小球的球旁器中颗粒细胞分泌肾素,肾素催化血管紧张素原生成AngI,AngI进一步由肺毛细血管上皮细胞分泌的血管紧张素转换酶(ACE)催化生成AngⅡ,即RAS的主要活性成分,AngⅡ通过与两种跨膜转运蛋白AT1R和AT2R发挥生物学活性[18]。AngⅡ大部分生理功能通过与ATlR结合而产生。局部AngⅡ抑制前脂肪细胞的分化,减少脂肪细胞的数量,促进脂肪细胞的肥大；血管紧张素Ⅱ还促进炎症因子的释放,引起脂肪组织炎症反应。有研究证实,在过表达AGT的小鼠脂肪组织中血管生成因子与炎症因子表达增加,从而引起局部胰岛素抵抗与脂肪组织血管重构(血管生成),并且循环中免疫细胞的浸润阻止前脂肪细胞分化,进一步介导血管收缩。AngⅡ通过活化NF-κB信号通路促进成熟脂肪细胞和前脂肪细胞促炎症因子释放,并且AngⅡ能作用于脂肪组织基质血管细胞,如单核细胞、巨噬细胞、T细胞发挥作用,而这些细胞都能表达RAS组分[15]。因此,脂肪组织RAS的活化可引起脂肪局部和机体全身的炎症反应。之前已经有研究证实在慢性肾衰大鼠脂肪组织内存在炎症反应并有RAS活化,但是这两者之间是否有联系尚不清楚,本实验旨在证实慢性肾衰时脂肪组织RAS活化对巨噬细胞表型的影响,并探讨其可能的机制。在体内用5/6肾切除大鼠作为慢性肾功能衰竭模型,观察RAS活化对脂肪组织炎症与巨噬细胞极性的影响,体外实验则用LPS或mIL-4加AngⅡ刺激RAW264.7巨噬细胞观察AngⅡ对巨噬细胞极性的影响。研究方法体内部分一、二步法5/6肾切除建立慢性肾衰模型1)腹腔注射麻醉大鼠：给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,俯卧位固定于鼠台上。2)酒精消毒,于大鼠左腹部中1/3脊柱旁开2-3cm处行纵行切口,切口长度约为2-3cm。3)依次切开皮肤和皮下组织,并剪开肌肉暴露肾脏,剥离肾包膜,用无损伤血管钳夹住肾蒂,切除肾脏的上下极约占左肾的2/3,明胶海绵压紧上下极创面止血,放松血管钳,观察创面不再渗血后还纳肾脏回腹腔,逐层缝合肌层及皮肤,酒精消毒手术切口。缝合前,腹腔内滴注青霉素注射液,预防感染。假手术组只做肾包膜剥离术。4)一周后,在脊柱右侧中1/3旁开2-3cm纵行切口(切口略高于左侧),分离肌层,游离肾脏,无损伤血管钳夹住肾蒂,4号丝线结扎肾蒂,切除右侧肾脏,观察有无出血,缝合肌层和皮肤,酒精消毒手术切口。假手术组只做肾包膜剥离术。二、大鼠RAS阻断剂ARB(替米沙坦)刺激5/6肾切除术后第12周,将慢性肾衰大鼠随机分为3组,第一组不作任何处理,第二组给予替米沙坦15mg/kg/d灌胃,第三组给予肼屈嗪20mg/kg/d灌胃,时间为4周。大鼠处死前两天测鼠尾动脉血压。三、大鼠血、尿和脂肪组织的留取及处理1术后第16周,测定大鼠血压后将大鼠放于代谢笼中,留取24小时尿,并测定24小时尿量与尿肌酐浓度。2)腹腔注射麻醉大鼠：给大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,仰卧位固定于鼠台上3)腹主动脉采血后,采用放血法处死大鼠,测定血肌酐浓度。4)酒精消毒皮肤,分离附睾和腹膜后脂肪垫(内脏脂肪)及腹股沟脂肪垫(皮下脂肪),迅速放入盛有1×PBS(PH7.4)的培养皿中。5)PBS反复清洗脂肪垫,剔除肉眼可见的血管,将脂肪垫剪成小块,包于锡箔纸中,液氮速冻,-80℃保存。四、脂肪组织炎症指标NF-κB的检测以及STAT1/3与SOCS1/3的表达Sham组、CRF组、CRF加替米沙坦组、CRF加肼屈嗪组大鼠皮下脂肪组织和内脏脂肪组织,按组织重量：裂解液=1：4的比例用匀浆器反复上下匀浆,以上操作均在冰上进行,匀浆完全后,13000g,4℃离心40min,去掉漂浮于上层的脂滴,提取中间层的匀浆液,即为脂肪组织的总蛋白,加入SDS(5×)上样缓冲液,95℃煮沸蛋白,Western Blotting检测脂肪组织NF-κB亚基p-P65、P65、 STAT1/3、p-STAT1/3、SOCS1/3的表达。五、real-time PCR检测皮下脂肪和内脏脂肪组织炎症因子和巨噬细胞表面标记物的表达Sham组、CRF组、CRF加替米沙坦组、CRF加肼屈嗪组大鼠皮下脂肪组织和内脏脂肪组织液氮砸碎,按组织重量：TRIZOL=1:10的比例匀浆,提取组织RNA,逆转录,qRT-PCR检测IL-6、MCP-1、TNF-α、iNOS、IL-1β、Arg1、CD206、 dectin的mRNA表达。六、统计方法所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数士标准差表示,所有统计分析由统计软件SPSS13.0完成。多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA,组间两两比较采用LSD法,P<0.05为差异有统计学意义。体外部分一、RAW264.7巨噬细胞的培养RAW264.7巨噬细胞采用美国ATCC细胞株。复苏后在37℃,5%CO2,10%FBS的高糖DMEM培养基中培养,传代。细胞状态良好时接种于培养板,每48小时换一次液,待细胞生长至融合后,换用不含FBS的DMEM中继续培养过夜,使细胞处于同步生长状态,然后用于实验。二、AngⅡ对LPS、IL-4诱导巨噬细胞极化的影响(时间、浓度效应)巨噬细胞分别与0.01、1、10umol/L AngⅡ或10ng/mL LPS、100ng/mL mIL-4同孵育16、20、24小时,并且在浓度和时间最高点加替米沙坦刺激,收集细胞提取RNA,qRT-PCR检测IL-1β、CDllc、iNOS、Arg1、CD206、dectin的mRNA表达。结果体内部分一、肾衰大鼠模型的确立在二步法5/6肾切除术后的第16周,采集大鼠尿液和血液测定血肌酐和肌酐清除率。在第16周时,慢性肾衰组大鼠体重和肌酐清除率与假手术组相比显著减少(P<0.05),而血肌酐和血压水平显著升高(P<0.001)。二、慢性肾衰对脂肪组织炎症和巨噬细胞极性的影响1、慢性肾衰促进皮下脂肪IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-1βmRNA的表达与NF-κB P65亚基磷酸化水平,抑制Arg1、 CD206、dectin mRNA表达CRF组皮下脂肪IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-1βmRNA的表达与Sham组相比显著增加(IL-6:P=0.001;:TNF-α:P=0.029; MCP-1:P<0.001; IL-1β:P<0.001;iNOS:P<0.001);而Arg1、CD206、dectin mRNA表达量则比Sham组明显减少(Arg1:P=0.001; CD206:P=0.001;dectin:P<0.001) NF-κB P65磷酸化水平与Sham组相比显著增强(P=0.002)。CRF组SOCS1的蛋白水平与Sham组相比明显减弱(P<0.001), SOCS3的蛋白水平与Sham组相比明显减弱(P<0.001), STAT1的磷酸化水平比Sham组明显增强(P=0.001), STAT3的磷酸化水平比Sham组明显增强(P<0.001)。2、慢性肾衰促进内脏脂肪IL-6. TNF-α、 MCP-1. iNOS. IL-1β mRNA的表达与NF-κB P65亚基磷酸化水,抑制Arg1、CD206、dectin mRNA表达CRF组内脏脂肪IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS. IL-1β mRNA的表达与Sham组相比显著增加(IL-6:P=0.004; TNF-α:P=0.023); MCP-1:P=0.016; iNOS:P<0.001; IL-1β:P=0.001);而Arg1、CD206、dectin mRNA的表达量则比Sham组明显减少(Argl:P<0.001; CD206:P=0.006; dectin:P<0.001). NF-κB P65的磷酸化水平与Sham组相比显著增强(P=0.032); SOCS1的蛋白水平与Sham组相比明显减弱(P<0.001), SOCS3的蛋白水平与Sham组相比明显减弱(P=0.004), STAT1的磷酸化水平比Sham组明显增强(P=0.001),STAT3的磷酸化水平比Sham组明显增强(P=0.031)。3、替米沙坦抑制慢性肾衰皮下脂肪炎症并改变巨噬细胞积极性CRF+替米沙坦组皮下脂肪IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-1βmRNA的表达与CRF组相比显著减弱(IL-6:P=0.002:; TNF-α:P=0.008; MCP-1:0.001; IL-1β:P<0.001; iNOS:P<0.001),而Arg1、CD206、dectin mRNA的表达量则比CRF组明显增强(Arg1:P<0.001; CD206:P<0.001;dectin:P=0.003), NF-κB P65的磷酸化水平与CRF组相比显著减弱(P=0.001); SOCS1的蛋白水平比CRF组明显增强(P<0.001), SOCS3的蛋白水平比CRF组明显增强(P=0.001); STAT1/3磷酸化水平与CRF组相比明显减弱(P<0.001)。4、替米沙坦抑制慢性肾衰内脏脂肪炎症并改变巨噬细胞极性CRF+替米沙坦组内脏脂肪IL-6、TNF-α、MCP-1、iNOS、IL-1βmRNA的表达与CRF组相比显著减弱(IL-6:P=0.006:; TNF-α:P=0.013; MCP-1:P=0.006; IL-1β.P=0.005; iNOS:P<0.001),而Arg1、CD206、dectin mRNA的表达量则比CRF组明显增强(Argl:P=0.049; CD206:P=0.006; dectin:P=0.038), NF-κB P65的磷酸化水平与CRF组相比显著减弱(P=0.031); SOCS1的蛋白水平比CRF组明显增强(P<0.001), SOCS3的蛋白水平比CRF组明显增强(P=0.007); STAT1磷酸化水平与CRF组相比明显减弱(P=0.001),STAT3磷酸化水平与CRF组相比明显减弱(P=0.029)。5、慢性肾衰对巨噬细胞极性的影响M1/M2型巨噬细胞比率以IL-1β/CD206表示,CRF组M1/M2与假手术组相比显著性升高(P<0.01)。结论慢性肾衰时脂肪组织存在炎症反应,替米沙坦抑制大鼠脂肪组织炎症并通过抑制SOCS1/3的表达、增加STAT1/3的磷酸化,从而促使巨噬细胞由M1型向M2型转换。体外部分一、AngⅡ对LPS与mIL-4诱导的巨噬细胞极化的影响AngⅡ以剂量依赖的方式上调LPS刺激后的巨噬细胞(RAW264.7细胞)IL-1β、CD1lc、iNOS mRNA的表达,并在10umol/L时达最高(IL-1β:F=168.363, P<0.001,CDllc:F=23.389, P<0.001, iNOS:F=60.192, P<0.001),抑制mIL-4刺激后的Arg1、CD206、dectin mRNA的表达(Argl:F=66.05, P<0.001, CD206: F=35.013; P<0.001; dectin:F=42.032,P<0.001);同时AngⅡ以时间依赖的方式上调LPS刺激后的巨噬细胞IL-1β、CDllc、iNOS mRNA的表达,刺激24小时IL-1β、CDllc、iNOSmRNA的表达最高(IL-1β:F=116.085, P<0.001, CD11c:F=61.221, P<0.001,iNOS:F=36.728,P<0.001),抑制mmIL-4刺激后的Arg1、CD206、dectin mRNA的表达(Argl:F=148.706,P<0.001, CD206: F=129.299; P<0.001; dectin:F=36.196, P<0.001).结论AngⅡ以剂量-时间依赖的方式对LPS和mIL-4诱导的巨噬细胞极化产生协同作用