【摘 要】
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本研究以昆明白小鼠为材料,从624例小鼠胎儿中分离培养原始生殖细胞(Primordial Germ Cells)并进行传代克隆和鉴定研究,探讨了影响胚胎生殖细胞(EG细胞)分离与培养的因素,为建立
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本研究以昆明白小鼠为材料,从624例小鼠胎儿中分离培养原始生殖细胞(Primordial Germ Cells)并进行传代克隆和鉴定研究,探讨了影响胚胎生殖细胞(EG细胞)分离与培养的因素,为建立昆明白小鼠EG细胞系奠定了基础,试验结果如下: 1.试验从7.5dpc~14.5dpc的昆明白小鼠胎儿分离培养原始生殖细胞,7.5dpc~9.5dpc取胎儿后1/3部分,包括原条后端和尿囊,10.5dpc~11.5dpc取泌尿生殖嵴,包括中肾和生殖嵴原基,12.5dpc~14.5dpc取生殖嵴,并克隆传代,最高传至第8代; 2.试验用分次消化法处理胎儿,对比不同的消化液对PGCs分离克隆的影响。0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA、0.05%胰蛋白酶+0.008%EDTA和0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA,三组消化差异不显著(P>0.05),都可以用于消化分离小鼠胎儿生殖嵴及复合物来获得PGCs; 3.试验比较了不同的培养系统:饲养层添加白血病抑制因子(LIF),饲养层不添加细胞因子,饲养层添加大鼠心肌细胞条件培养基,结果是SD大鼠心肌条件培养基能够较好地用于分离培养昆明白小鼠PGCs,与添加LIF组差异不显著(P>0.05),但明显好于未添加细胞因子组,可以用于昆明白小鼠PGCs的分离培养; 4.试验比较了不同传代方法对小鼠胚胎生殖细胞(EG细胞)传代的影响,发现“手工传代”和“连同成纤维细胞一起消化”相比获得了较高的传代比率(P<0.05),手工传代“消化+连续离散”有利于保持传代细胞的增殖活力,尤其适合于EG细胞的后期传代; 5.试验比较了取胎儿身体后1/3部分共培养、生殖嵴共培养、“差速贴壁”培养和穿刺生殖嵴4种分离PGCs的方法对EG细胞分离克隆的影响,结果表明:生殖嵴共培养和差速贴壁方式获得了较好的分离效果(P<0.05); 6.对所分离的EG细胞经形态观察、AKP染色、体外分化能力检测,证实其符合小鼠EG细胞的一系列特征。
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