糖尿病(diabetes mellitus, DM)已成为21世纪威胁人类生命健康的慢性重大疾病之一。随着社会经济的快速发展,人民生活水平的不断提高和生活方式的改变,糖尿病的发病率明显提高。而2型糖尿病患者数量的激增是导致全世界糖尿病患者总数激增的主要原因。在我国糖尿病患者人数已位居世界第二位。糖尿病慢性并发症如心脑血管疾病、糖尿病足、糖尿病肾病、糖尿病周围神经病变以及糖尿病视网膜病变糖尿病所引起的失明、截肢、尿毒症等严重后果,不仅影响着人类的健康及生活质量,同时给社会也带来了沉重的负担。如何减轻2型糖尿病患者胰岛β细胞氧化损伤及恢复β细胞功能及数量,仍是当下治疗糖尿病的难点及热点。在2型糖尿病的发病过程中,人体在高血糖和高脂肪酸的刺激下,产生大量氧自由基,引起氧化应激是导致胰岛β细胞功能损伤的主要原因。高浓度葡萄糖进入细胞内使活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)产生增多,促发氧化应激,启动核转录因子-кB(nuclear factor of KappaB, NF-κB)途径,增加诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的转录和表达,使一氧化氮(NO)生成增加,过量的NO可与超氧阴离子(superoxide,O2)迅速结合生成氧化作用更强的过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite, ONOO-), ONOO-对胰岛β细胞有强烈的细胞毒性作用,可促进β细胞凋亡,ONOO-还可以硝化胰岛素酪氨酸残基并生成代谢物硝基酪氨酸(nitrotyrosine, NT),使胰岛素结构和功能发生改变,影响其生理作用。如何恢复胰岛β细胞功能和数量,促进胰岛素分泌是2型糖尿病治疗的关键。叉头框蛋白01(forkhead boxO1, FoxO1)是一种调节胰岛素合成的转录因子,是胰岛素/胰岛素样生长因子-1(insulin/insulin-like growth factors, INS/IGF-1)信号通路中的下游关键分子,受上游分子磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol3-kinase/protein kinas B, PI3k/Akt))磷酸化调控,与细胞的周期、凋亡、衰老以及代谢都有着密切的联系。胰岛十二指肠同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1, PDX-1)是FoxO1下游的靶基因,它是胰岛β细胞、γ细胞及分散在十二指肠的内分泌细胞的转录因子。PDX-1基因的活化可以促进胰岛素、生长抑素、葡萄糖激酶、葡萄糖转运子2及胰岛淀粉样多肽(glucagon-like peptide-1, GLP-1)等β细胞重要基因的表达。葡萄糖影响PDX-1的表达,可迅速激活PDX-1与DNA的结合,影响PDX-1磷酸化,调控PDX-1在细胞核和细胞浆之间的分布,参与胰岛素基因的转录,对胰腺的发育、分化,胰岛p细胞增殖及抑制凋亡等都有着极其重要的作用。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)为二硫氨基酸酯,因其分子所含巯基(thio1)结构,具有抗氧化及金属螯合作用,可以抑制NF-κB活性,减少多种炎症介质的生成,从而减轻胰岛p细胞的损伤。本课题采用高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)腹腔注射的方法成功建立2型糖尿病大鼠模型,并经PDTC (50mg/kg/d,IP)干预1周,通过对各组大鼠口服糖耐量与胰岛素耐量实验；胰腺组织中NF-κB表达、iNOS、NT水平及胰岛β细胞凋亡情况。确定PDTC对糖尿病大鼠的降糖作用及抗氧化应激、抗硝基化反应以及对胰腺p细胞损伤的保护作用。通过测定各组胰腺组织中胰岛素含量,转录因子PDX-1的表达水平,以及FoxO1磷酸化,FoxO1乙酰化水平,探讨PDTC促进胰岛p细胞分泌胰岛素的作用及其可能机制。本研究包括以下三部分：第一部分吡咯烷二硫代氨基甲酸酯改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗目的：探讨PDTC改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用。方法：参照Reed等方法建立2型糖尿病大鼠模型。8周龄健康雄性Wistar大鼠37只,体重180-210g。随机分为正常对照组(NC组)12只和高脂饮食组(HFD组)25只,NC组以标准大鼠饲料喂养,HFD组以高脂高糖饲料喂养。8周后经口服葡萄糖耐量实验(oral tolerance test, OGTT)和胰岛素耐量实验(insulin tolerance test, ITT)证实,高脂饮食喂养的大鼠出现胰岛素抵抗后,给予一次性腹腔注射STZ(27mg/kg体重),NC组大鼠给予同等体积的柠檬酸钠缓冲液腹腔注射,72小时后内眦静脉取血测定血糖,以随机血糖≥16.7mmol/L为2型糖尿病大鼠造模成功,共成功造模24只。将造模成功大鼠随机分为糖尿病组(DM组)和PDTC治疗组(DM+PDTC组)。PDTC治疗组大鼠每日腹腔注射PDTC (50mg/kg),NC组和DM组大鼠每日给予同等体积的生理盐水腹腔注射。通过OGTT与ITT测定各组大鼠胰岛素抵抗和胰岛素敏感性。结果：1.高脂喂养大鼠胰岛素抵抗模型的建立实验第8周,通过对各组大鼠进行OGTT,可以看出,HFD组大鼠各时间点血糖水平均较NC组明显升高,90min血糖达高峰,在2h左右时未能下降至正常水平；HFD组葡萄糖曲线下面积(area under the curve,AUC)明显高于NC组有统计学意义(P<0.05)。葡萄糖刺激后胰岛素释放功能结果显示：HFD组大鼠各时间点胰岛素分泌水平较NC组大鼠明显升高,有显著性差异(P<0.01),HFD组大鼠胰岛素曲线下面积AUC明显高于NC组,有显著性差异(P<0.01)。胰岛素耐量实验显示,HFD组各时间点血糖水平均高于NC组,胰岛素耐量葡萄糖曲线下面积(AUC)HFD组明显高于NC组,统计学有显著性差异(P<0.01)2. PDTC改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗PDTC治疗1周后,再次行OGTT,可以看出,PDTC治疗后大鼠各时间点血糖水平均明显低于DM组大鼠,在2h左右时下降到接近正常水平,2h时间点血糖水平与DM组比较有统计学意义(P<0.05)。葡萄糖刺激后胰岛素释放功能结果显示：PDTC治疗后大鼠各时间点胰岛素分泌水平较DM组大鼠明显降低,有统计学差异(P<0.05)。PDTC治疗后大鼠葡萄糖曲线下面积AUC与胰岛素曲线下面积AUC均无统计学差异。胰岛素耐量结果显示：PDTC治疗组各时间点血糖水平明显低于DM组,其中0min、15min、30min时间点有显著性差异(P<0.01),PDTC治疗后大鼠胰岛素耐量葡萄糖曲线下面积明显低于DM组大鼠,有显著性差异(P<0.01)。从以上结果可以看出,PDTC治疗后大鼠胰岛素水平低于DM组大鼠,但PDTC治疗后大鼠各时间点葡萄糖水平明显低于DM组大鼠,说明PDTC可改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗,提高胰岛素敏感性。结论：1. PDTC可降低大鼠血糖水平；2. PDTC可改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗,提高胰岛素敏感性。第二部分吡咯烷二硫代氨基甲酸酯对2型糖尿病大鼠胰岛p细胞氧化损伤的保护作用目的：测定各组大鼠胰腺组织中诱生型iNOS、NT及NF-κB的水平及胰岛β细胞凋亡情况,探讨PDTC对2型糖尿病大鼠胰岛p细胞氧化损伤的保护作用及其机制。方法：应用免疫组化、免疫荧光染色和Western blot等方法检测胰腺组织中iNOS及NT的生成水平及NF-κB在细胞核与细胞浆的分布情况；流式细胞术检测胰岛p细胞凋亡百分率。结果：1.PDTC对2型糖尿病大鼠胰岛p细胞凋亡的影响：DM组大鼠胰岛p细胞凋亡率明显高于NC组(P<0.01)；PDTC治疗后大鼠胰岛p细胞凋亡率明显低于DM组(P<0.05)2.各组大鼠胰腺组织形态学变化：经HE染色,显微镜下观察可见,NC组胰腺胰岛形态规则,胰岛内细胞数量较多,排列整齐,大小一致,分布均匀。DM组胰岛结构明显破坏,胰岛内细胞数量明显减少,分布稀疏,形态不规则,排列紊乱,可见空泡样变。PDTC治疗后大鼠胰岛形态较糖尿病组胰岛内细胞明显增多,细胞结构明显改善。3.各组胰腺组织中iNOS生成情况：iNOS免疫组化染色结果显示：DM组大鼠胰腺p细胞胞质中呈强阳性反应,NC组大鼠胰腺组织中仅见较弱的iNOS阳性反应信号,PDTC治疗后大鼠胰腺组织iNOS阳性反应细胞较糖尿病组明显减少(P<0.01)；Western blot测定胰腺组织中iNOS表达：DM组大鼠胰腺组织中iNOS水平明显高于NC组,PDTC治疗后胰腺组织中iNOS水平明显低于DM组(P<0.05)。4.各组胰腺组织中NT生成情况：NT免疫组化染色结果显示：DM组大鼠胰腺p细胞胞质中呈强阳性反应,NC组大鼠胰腺组织中仅见较弱的NT阳性反应信号,PDTC治疗后大鼠胰腺组织NT阳性反应细胞较糖尿病组明显减少(P<0.01)；Western blot测定胰腺组织中NT表达：DM组大鼠胰腺组织中NT水平明显高于NC组,PDTC治疗后胰腺组织中NT水平明显低于DM组(P<0.05)。5.各组胰腺组织中NF-κB的生成及它在胰腺组织细胞内核浆分布情况：Western blot检测结果显示：DM组大鼠胰岛细胞胞核内NF-κB表达水平明显高于NC组,PDTC治疗后胰岛细胞核内NF-κB表达水平明显降低(P<0.05)。结论：1.2型糖尿病大鼠胰腺组织中iNOS、ONOO生成明显增多,提示氧化应激在糖尿病胰腺组织损伤中起重要作用；2.PDTC可通过降低NF-κB转录活性,降低iNOS的表达及ONOO的生成,减轻氧化应激导致的糖尿病大鼠胰岛细胞的损伤。第三部分吡咯烷二硫代氨基甲酸酯通过调控转录因子PDX-1与FoxO1影响胰岛p细胞合成胰岛素目的：通过测定各组大鼠胰腺组织中胰岛素含量以及转录因子PDX-1、FoxO1磷酸化、FoxO1乙酰化水平,探讨PDTC通过调控转录因子PDX-1与FoxO1影响胰岛β细胞合成胰岛素的作用机制。方法：应用免疫组化染色方法测定胰腺组织胰岛素的含量；Western blot与免疫组化等方法检测胰腺组织中PDX-1表达,FoxO1乙酰化水平,以及PDX-1与FoxO1在胰岛β细胞中核浆分布情况。结果：1.免疫组化观察各组大鼠胰腺组织insulin的含量：NC对照组大鼠胰腺组织中insulin呈强阳性反应,DM组大鼠胰腺组织中insulin阳性反应信号明显减低,PDTC治疗后大鼠胰腺组织insulin阳性反应细胞较糖尿病组明显增多。2.各组胰腺组织中PDX-1生成及其在胰岛p细胞核浆中分布情况：免疫组化观察各组大鼠胰腺组织PDX-1的生成：NC组大鼠胰腺组织中PDX-1呈强阳性反应,DM组大鼠胰腺组织中仅见较弱的PDX-1阳性反应信号,PDTC治疗后大鼠胰腺组织PDX-1阳性反应细胞较糖尿病组明显增多；激光共聚焦显微镜观察发现,NC组大鼠胰岛β细胞中PDX-1主要分布在细胞核内；DM组大鼠胰岛p细胞核内仅见较弱的PDX-1阳性信号,PDTC治疗组大鼠胰岛p细胞中PDX-1也主要分布在细胞核内；West-ern Blot检测显示：DM组大鼠胰腺组织细胞核蛋白中PDX-1的表达量明显低于NC组,PDTC治疗后胰腺组织细胞核蛋白中PDX-1的表达量明显高于DM组；DM组大鼠胰腺组织细胞浆蛋白中PDX-1的表达量明显高于NC组,PDTC治疗后胰腺组织细胞浆蛋白中PDX-1的表达量明显低于DM组。以上结果提示PDTC可促进PDX-1从细胞浆转位至细胞核。3.各组胰腺组织中FoxO1磷酸化水平及其它在胰岛β细胞中核浆分布情况：免疫组化观察各组大鼠胰腺组织FoxO1磷酸化水平：DM组大鼠胰腺组织中p-FoxO1呈强阳性反应,NC组大鼠胰腺组织中仅见较弱的p-FoxO1阳性反应信号,PDTC治疗后大鼠胰腺组织p-FoxO1阳性反应细胞较糖尿病组明显减少；激光共聚焦显微镜观察各组大鼠胰岛β细胞FoxO1磷酸化水平：DM组大鼠胰岛p细胞p-FoxO1主要分布在细胞核内,NC组大鼠胰岛β细胞核中仅见较弱的p-FoxO1阳性信号,PDTC治疗后大鼠胰岛p细胞胞核内p-FoxO1阳性反应信号较糖尿病组明显减少。4.各组胰腺组织中FoxO1乙酰化水平：免疫组化观察各组大鼠胰腺组织FoxO1乙酰化水平：DM组大鼠胰腺组织中呈强阳性反应,NC组大鼠胰腺组织中仅见较弱的Ac-FoxO1阳性反应信号,PDTC治疗后大鼠胰腺组织Ac-FoxO1阳性反应细胞较糖尿病组明显减少；Western Blot检测结果显示：DM组大鼠胰腺组织中Ac-FoxO1的量明显高于NC对照组,PDTC治疗后胰腺组织中Ac-FoxO1的表达量明显降低。结论：PDTC通过抑制FoxO1的磷酸化和乙酰化,抑制其入核,解除对PDX-1的抑制,从而促进胰岛β细胞合成胰岛素。