肠道病毒是手足口病(Hand-foot-and-mouth disease,HFMD)主要病原体,该病多见于5岁以下儿童,主要引起手、足、口部出现疱疹,往往具有自限性。但重症HFMD则伴有脑脊髓膜炎等严重的并发症。肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是引起重症HFMD的主要病原体,目前尚无特效的抗病毒药物。虽然已有疫苗上市,且免疫效果良好,但其神经毒力依然未被阐明。EV71基因全长编码4个结构蛋白,VP1～VP3在核衣壳外部,VP4位于内部。VP1是EV71分型的依据,同时也是主要的抗原决定位点。多数研究证明EV71结构蛋白VP1与病毒的毒力有关,并从中筛选出多个毒力位点。然而,目前VP调节病毒毒力的机制尚不清楚。大量研究证明细胞自噬能够影响EV71毒力,EV71亦可调节自噬流来促进自身复制。然而,细胞自噬影响EV71复制的机制尚未被阐明。本研究基于EV71强毒株的感染性cDNA克隆,即将其VP1编码区置换为相应弱毒株编码区,而获得重组毒株SDLY107-VP1。并在此基础上研究了 VP1蛋白突变对EV71复制水平的影响,探索其机制。研究结果表明,VP1蛋白可通过影响神经细胞株的自噬能力进而改变EV71的复制能力,并进一步揭示mTOR信号分子可能参与VP1对细胞自噬影响的通路。该研究结果为进一步阐述手足口病神经毒力机制、抗病毒药物的研发提供理论依据。目的1.探讨VP1蛋白影响EV71复制能力的机制。2.研究细胞自噬对EV71复制的影响。3.探究EV71诱导细胞自噬的机制。方法1.分别检测三株EV71病毒在RD细胞和SH-SY5Y细胞中复制能力。2.用重组毒株和亲本毒株以相同的MOI分别感染细胞,检测自噬相关蛋白含量变化,分析VP1蛋白对细胞自噬的作用。3.使用自噬抑制剂3-MA、CQ以及自噬诱导剂雷帕霉素改变细胞自噬状态,研究细胞自噬对EV71毒力的影响。4.用重组EV71病毒和亲本毒株分别感染RD细胞和SH-SY5Y细胞,探究EV71影响细胞自噬的机制。结果1.SDLY107株、SDLY107-VP1株以及SDJN2015-01株在RD细胞中均能诱导细胞自噬,且在RD细胞中,三株EV71毒株的复制水平没有显著差异。但重组病毒SDLY107-VP1株在神经细胞内的复制水平及影响自噬流的能力明显比强毒株SDLY107株弱,与弱毒株SDJN2015-01株相似。2.3-MA阻碍自噬体形成后,细胞内EV71 VP1蛋白含量没有明显变化,但细胞培养上清中病毒滴度下降;CQ抑制自噬溶酶体降解后,细胞内病毒VP1蛋白含量及培养上清中病毒滴度明显升高;雷帕霉素促进自噬体降解后,细胞内VP1含量及培养上清中病毒滴度均降低。3.3-MA阻碍自噬体形成后,对细胞损伤程度没有明显影响;CQ阻碍自噬溶酶体降解后,细胞损伤程度升高;雷帕霉素促进自噬体降解后,细胞损伤程度降低。4.EV-A71感染细胞后,抑制mTOR磷酸化,雷帕霉素抑制mTOR可在RNA水平抑制病毒的复制。结论1.EV71可诱导RD细胞发生不完全的细胞自噬,其结构蛋白VP与病毒的神经毒力有关。2.自噬体的形成和积累有利于EV71的复制,而自噬体的降解有利于病原体的清除。EV71的复制得益于自噬体的稳定不被降解。VP1蛋白通过影响病毒在SH-SY5Y细胞中诱导细胞自噬的能力进而调节病毒在神经细胞中的复制能力。3.EV71诱导的细胞自噬与mTOR信号分子有关,mTOR在RNA水平上调节EV71复制。VP1通过mTOR调节细胞自噬,进而影响病毒复制。