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目的: 本研究针对XIST的敲低建立了在HEK293T细胞中的CRISPR/Cas9基因组编辑系统,以及利用该系统揭示非编码基因miRNA-146a新的转录调控机制。 方法: 1.本研究利用CRISPR/Cas9系统和TALEN技术在HEK293T细胞中对已知的XIST的核心启动子进行编辑,建立了通过酶切、测序等鉴定突变效率的方法,并且结合极限稀释法、片段分析和TA克隆测序得到基因型确定的XIST低表达的单克隆细胞系。 2.利用CRISPR/Cas9技术突变miRNA-146a多个潜在的转录调控区域,鉴定调控miRNA-146a转录的关键区域。 3.使用荧光定量PCR、荧光素酶报告基因、DNA甲基化分析和染色质免疫沉淀等技术揭示miRNA-146a转录调控的新机制。 结果: 1.成功建立优化后的针对HEK293T细胞进行基因组编辑的CRISPR/Cas9系统;CRISPR/Cas9和TALEN对XIST核心启动子的突变可以有效地抑制XIST的表达。 2.位于miRNA-146a初级转录本内含子区的单碱基chr5:159912213(GRCh37/hg19)的缺失导致显著的miRNA-146a的转录上调。 3.单碱基chr5:159912213(GRCh37/hg19)的缺失可导致整个miRNA-146a宿主基因的RNA转录产物的增加和RNA聚合酶II结合的增加。 结论: 1.针对XIST核心启动子的基因组编辑可以干预XIST的表达,这为长链非编码RNA基因的敲低提供了新的思路。 2.人基因组中chr5:159912213(GRCh37/hg19)及其周围区域是一个重要的miRNA-146a的转录抑制位点。 3.人基因组中chr5:159912213(GRCh37/hg19)及其周围区域通过与miRNA-146a的核心启动子区互作影响miRNA-146a的表达。