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本研究分别从离体血细胞添加铜和水体中添加铜的两个方面,首次应用流式细胞术,并结合生理生化方法,研究铜对斑节对虾血细胞状态、细胞免疫功能和体液免疫功能的影响,以探讨其对斑节对虾免疫功能的影响和致死机制。
向离体的斑节对虾血细胞孵育液中添加不同浓度(10-9M-10-3M)的铜离子,研究铜对血细胞生理状态和免疫功能的影响。高浓度的铜离子(10-3,10-4M)使超氧阴离子含量在6h内上升,而后逐渐下降;细胞的呼吸爆发在12h之内增强,而12h后迅速减弱,可能是抗氧化酶被激活而对O2-和H2O2进行消除所致。在高浓度铜条件下细胞的线粒体膜电位下降,表明在高浓度铜的应激条件下细胞被诱导发生凋亡,细胞存活率检测也表明高浓度铜离子使细胞的死亡数增加,由此表明高浓度的铜离子由于会使细胞产生大量的活性氧,而诱导了细胞的凋亡,最终使死亡细胞数量不断上升。而10-8M铜有利于细胞的存活,该浓度可能有利于对虾血细胞的体外培养。胞质内钙离子含量在铜离子浓度高时下降,在浓度低时先上升后下降,这表明不同浓度的铜离子对钙含量的调节存在差异。10-9M和10-8 M的铜离子使吞噬率提高,而10-7M-10-3M铜离子抑制细胞吞噬功能,且铜浓度越高,抑制效果越大。细胞悬液中的酚氧化酶活性也被高浓度铜离子所激活,可能与酚氧化酶有铜的结合位点有关。综合各类指标的变化情况,可把铜离子效用浓度分为三个级别:10-9M-10-8M,10-7M-10-5M,10-4M-10-3M。
铜对斑节对虾的24h、48h、72h、96h的LC50分别为3.488、1.544、0.725、0.403 mg/L。根据LC50设置应激浓度,研究水体铜离子对斑节对虾血细胞状态、细胞免疫和体液免疫功能的影响。结果表明,3.5和1.5 mg/L的水体铜离子使虾血细胞的呼吸爆发增强、超氧阴离子含量及钙离子浓度增加、细胞凋亡率上升、血细胞总数下降,表明水体中高浓度的铜离子通过刺激血细胞中活性氧含量的上升,同时使钙平衡失调,诱导了血细胞的凋亡,最终表现出血细胞总数下降,这可能是高浓度铜离子使虾类中毒致死的重要原因之一。高浓度铜离子使PO和肌肉SOD活力下降,使肝胰腺SOD活力、肌肉和肝胰腺GPX活力、血蓝蛋白含量都先上升后下降,表明高浓度的水体铜离子先诱导了这些酶活力和血蓝蛋白含量的上升,随着应激时间的延长,变为产生了抑制作用。血蓝蛋白是载氧蛋白,其含量的下降会使虾体的供氧能力下降,可能也是高浓度铜离子造成虾中毒死亡的重要原因之一。PO活力的下降也会导致的虾体抗病能力的下降。抗氧化酶活力的下降也会使虾体受到活性氧的损害,也可能是致命的原因之一。结合呼吸爆发和超氧阴离子含量的变化情况,表明抗氧化酶可能在较低产量的活性氧成分时被激活,而较高量的活性氧成分被抑制。