下背痛(Low back pain,LBP)是一种常见的腰部疾病,它影响着全球一半以上的成年人。椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration,IVDD)可引起衰弱性疼痛,并且是导致LBP的关键因素。IVDD不仅降低了患者生活质量并给LBP患者带来了沉重的经济负担。IVDD的特征主要包括细胞外基质分解增加,基质合成异常引起的水合作用减少,椎间盘高度降低和承受负荷的能力降低。相邻的椎体通过椎间盘(Intervertebral disc,IVD)相连,椎间盘在轴向压缩过程中使躯干保持一定的柔韧性和机械稳定性。IVD由专门的结缔组织结构组成,其存在三个形态学上不同的区域,包括髓核(Nucleus pulposus,NP),纤维环(Annulus fibrosis,AF)和软骨终板。尽管IVDD的确切机制尚不清楚,但据研究报道,IVDD与多种因素相关。例如,已经有研究证明NP细胞的异常增殖和NP细胞簇的形成在IVDD中起着重要作用。表皮生长因子受体(EGFR)在与其配体结合后可诱导NP细胞增殖,并与IVDD中的组织退化程度呈正相关。Erb B受体反馈抑制剂1(Erb B receptor feedback inhibitor 1,ERRFI1)也被称为有丝分裂原诱导基因-6(Mitogen-inducible gene-6,Mig-6),它是EGFR的负调控因子,在EGFR信号网络的衰减中起重要作用。机械应力可以诱导IVD区域内各种细胞因子的释放,并引起疼痛,炎症和组织损伤。肿瘤坏死因子TNF-α可以降低蛋白聚糖和II型胶原蛋白(IVDs的两个主要结构成分)的表达水平。白介素IL-1β可诱导IVD细胞降解蛋白聚糖并抑制基质的生物合成。IL-6可增强IL-1β和TNF-α对NP细胞的分解代谢作用,并降低蛋白聚糖的合成。这些细胞因子可促进基质降解并导致IVDD病理进展。因此抑制这些炎症细胞因子可以作为治疗IVDD的有效方法。MicroRNAs(mi RNAs)是一类内源性的具有调控功能的非编码小RNA(一般大小约为22个核苷酸),可与3’非翻译区(3’UTR)结合配对并调控靶基因表达。Mi RNAs参与调节多种细胞功能包括细胞增殖,分化与发育。有大量研究报道,mi RNAs可参与调节IVDD进程。例如,mi R-494促进NP细胞凋亡和细胞外基质降解,mi R-10b可通过靶向IVDD中的同源框基因D10来促进NP细胞增殖。最近一项研究通过基因芯片检测技术发现,IVDD中总共有25种mi RNAs表达呈上调趋势,有26种mi RNAs表达是下调的,其中发现mi R-2355-5p表达水平被上调。到目前为止,mi R-2355-5p和ERRFI1在IVDD发病中的确切机制作用尚不清楚。因此在本研究课题中,旨在探讨mi R-2355-5p和ERRFI1在IVDD中的表达水平,并进一步阐明它们在IVDD中的作用机制,为IVDD的预防及治疗提供理论依据。第一部分mi R-2355-5p和ERRFI1在IVDD中的表达水平目的:探究mi R-2355-5p和ERRFI1在IVDD中是否起作用。方法:1.q RT-PCR检测35例IVDD病人的NP组织样本和15例正常NP组织样本中ERRFI1和mi R-2355-5p的表达水平。2.使用脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激NP细胞来模拟IVDD,并用q RT-PCR检测经10mg/ml LPS处理6h、12h、24h和48h后的NP细胞中ERRFI1和mi R-2355-5p的表达水平。3.分析35例IVDD病人的NP组织样本中mi R-2355-5p和ERRFI1m RNA表达水平的相关性。结果:1.ERRFI1在IVDD NP组织样本中表达下调而mi R-2355-5p表达上调q RT-PCR结果显示,ERRFI1在IVDD患者的NP组织样本中的m RNA表达水平要明显低于正常NP组织(P<0.01)。相反,mi R-2355-5p在IVDD患者的NP组织样本中的表达水平要明显高于正常NP组织(P<0.01)。并且ERRFI1和mi R-2355-5p在35例IVDD患者的NP组织样本中的表达水平存在明显的负相关性(R=-0.3765,P<0.05)。2.mi R2355-5p和ERRFI1在NP细胞中的表达应答于LPSq RT-PCR结果显示,ERRFI1的m RNA表达水平随着LPS刺激而下调,在经LPS刺激6h时,ERRFI1的m RNA表达水平开始显著降低。相反,mi R-2355-5p表达水平随着LPS刺激而上调,并且在经LPS处理后12h,24h,48h,mi R-2355-5p表达水平开始显著增加。结论:mi R2355-5p在IVDD中表达水平上调,而ERRFI1在IVDD中表达水平下调。同时,mi R2355-5p和ERRFI1在NP细胞中的表达应答于LPS。第二部分ERRFI1在NP细胞中的调控功能目的:探究ERRFI1是否也可以抑制NP细胞的生长,以及ERRFI1对LPS刺激的NP细胞中炎性细胞因子产生的潜在影响。方法:1.用ERRFI1过表达质粒p CMV-ERRFI1(ERRFI1-oe)或空载体(Vec)分别转染NP细胞,并在转染48h后用q RT-PCR和western blot的方法分别检测ERRFI1的m RNA和蛋白表达水平。2.2.用CCK-8检测转染ERRFI1-oe或空载体(Vec)的NP细胞在第1天至第五天的细胞活力。3.3.用q RT-PCR和western blot的方法分别检测转染ERRFI1-oe或空载体(Vec)的NP细胞中的两个重要增殖标志物cyclin D1和PCNA的RNA和蛋白表达水平。4.4.首先用ERRFI1-oe或空载体(Vec)转染NP细胞,然后用10 mg/ml LPS刺激NP细胞48h,并通过q RT-PCR和ELISA的方法检测转染ERRFI1-oe或空载体(Vec)的NP细胞在接受LPS刺激后炎性细胞因子TNF-α,IL-1β和IL-6的RNA和蛋白表达水平。结果:1.过表达ERRFI1可抑制NP细胞的增殖转染p CMV-ERRFI1表达质粒的NP细胞中ERRFI1的m RNA和蛋白质表达水平相对于转染空载体的NP细胞均显示出显著的增加(P<0.001),说明ERRFI1在NP细胞中成功地进行了过表达;CCK-8检测结果显示,转染ERRFI1表达质粒的NP细胞的细胞活力低于转染空载体的NP细胞,并且在转染后的第5天,两者之间的差异变得显著(P<0.001);同时结果显示,ERFFI1的过表达显著抑制了细胞周期蛋白D1和PCNA的m RNA和蛋白表达水平(P<0.05)。综上所述表明ERFFI1可抑制NP细胞的增殖。2.ERRFI1可抑制LPS诱导的NP细胞中炎性细胞因子的产生炎症介质参与了IVDD的发展,ERRFI1可以负调控炎症介质的产生。我们的结果与先前的研究报道相一致,经LPS刺激后NP细胞中炎性细胞因子TNF-α,IL-1β和IL-6的RNA和蛋白表达水平都明显升高,也就是说LPS刺激可诱导NP细胞产生大量的炎性细胞因子TNF-α,IL-1β和IL-6。相反,转染ERRFI1表达质粒的NP细胞在接受LPS刺激后炎性细胞因子TNF-α,IL-1β和IL-6的RNA和蛋白表达水平都呈现出明显的下调。结论:ERRFI1可抑制LPS诱导的NP细胞中炎性细胞因子的产生。第三部分mi R2355-5p参与调控NP细胞相关功能的具体机制目的:探究mi R2355-5p是否参与调控NP细胞的相关功能以及调控机制。方法:1.使用在线预测软件Targetscan来预测mi R-2355-5p的下游功能靶标。2.通过双荧光素酶报告载体实验来验证ERRFI1是mi R-2355-5p的功能靶标这一预测结果。3.用3’端生物素标记的mi R-2355-5p或mi R-NC在NP细胞中进行pull-down实验,进一步验证mi R-2355-5p与ERRFI1 m RNA之间的相互作用关系。4.用q RT-PCR和western blot的方法检测在NP细胞中过表达mi R-2355-5p或抑制mi R-2355-5p对ERRFI1的m RNA和蛋白表达水平的影响。5.通过共转组合实验(NC-inhibitor+si-NC;NC-inhibitor+si-ERRFI1;mi R-2355-5p-inhibitor+si-NC;mi R-2355-5p-inhibitor+si-ERRFI1)来证明Mi R-2355-5p是否参与调控ERRFI1对NP细胞相关功能的影响。结果:1.Mi R-2355-5p靶标于ERRFI1的3’UTRTargetscan预测结果发现ERRFI1 3’端非编码区包含保守的mi R-2355-5p结合位点,通过荧光报告实验结果显示mi R-2355-5p可显著降低野生型ERRFI1 3’UTR驱动的荧光报告活性,而对突变型ERRFI13’UTR驱动的荧光报告活性没有影响。生物素标记的RNA pulldown实验发现生物素标记的mi R-2355-5p能有效富集ERRFI1的m RNA。最后通过q RT-PCR和western blot检测发现过表达mi R-2355-5p能抑制ERRFI1的表达,而敲低mi R-2355-5p促进ERRFI1的表达。综上表明mi R-2355-5p通过直接结合ERRFI13’UTR而抑制ERRFI1的表达。2.Mi R-2355-5p参与调控ERRFI1对NP细胞功能的影响q RT-PCR和western blot检测发现,与对照组(NC-inhibitor+si-NC)相比,转染(NC-inhibitor+si-ERRFI1)组合的NP细胞中ERRFI1的表达水平明显下调,这表明ERRFI1 si RNA有效地敲低了NP细胞中ERRFI1的表达水平。与对照组相比,(mi R-2355-5p-inhibitor+si-NC)组合转染导致NP细胞中ERRFI1的m RNA水平明显增加,说明抑制mi R-2355-5p可以增强ERRFI1的表达。与对照组相比,mi R-2355-5p抑制剂和ERRFI1 si RNA的共转染(mi R-2355-5p-inhibitor+si-ERRFI1)没有明显改变NP细胞中ERRFI1的m RNA水平。此外,检测结果还发现,转染si-ERRFI1完全阻断了由mi R-2355-5p抑制引起的ERRFI1上调,这表明ERRFI1 si RNA的敲低非常有效。CCK-8检测实验证明,与对照组相比,共转染(NC-inhibitor+si-ERRFI1)的NP细胞显示细胞活力明显增强。相反,共转(mi R-2355-5p-inhibitor+si-NC)组合的NP细胞的细胞活力明显低于对照组。这些数据表明mi R-2355-5p具有与ERRFI1相反的功能。此外,在转染mi R-2355-5p抑制剂的NP细胞中再敲低ERRFI1可明显增强NP细胞活力,表明抑制mi R-2355-5p对NP细胞增殖的影响依赖于ERRFI1。同时,我们研究结果发现,敲低ERRFI1会导致细胞周期蛋白D1和PCNA的m RNA和蛋白质表达水平明显增加,抑制mi R-2355-5p可显著降低细胞周期蛋白D1和PCNA的表达,在抑制mi R-2355-5p的基础上进一步敲低ERRFI1可恢复D1和PCNA的表达水平。最后我们通过q RT-PCR和ELISA方法检测经过共转的NP细胞在LPS刺激后的相关炎性细胞因子变化。我们研究结果发现,敲低ERRFI1可以明显上调LPS诱导的NP细胞中TNF-α,IL-1β和IL-6的m RNA和蛋白表达水平。相反,mi R-2355-5p抑制剂可明显抑制LPS诱导的NP细胞中促炎性细胞因子的产生,但是在抑制mi R-2355-5p的同时再敲低ERRFI1又可恢复NP细胞中TNF-α,IL-1β和IL-6的RNA和蛋白表达水平,这表明抑制mi R-2355-5p对LPS诱导的NP细胞中炎性细胞因子的影响也依赖于ERRFI1。综上所述表明,mi R-2355-5p通过负调控ERRFI1而促进NP细胞增殖和NP细胞在LPS刺激后的炎症应答。结论:Mi R-2355-5p负调控ERFFI1并抑制ERRFI1对NP细胞增殖和炎症的抑制作用。