研究背景:我国是胃癌的高发国家,胃癌发病率居我国肿瘤第三位,死亡率居第三位。尽管随着现代医学的飞速发展,早期胃癌的筛查技术及进展期胃癌的治疗方法都取得了一定的进步,但是尚不能从根本上改善胃癌患者的预后。进展期胃癌具有发病隐匿、进展迅速、恶性程度高、易复发等特点,因此,深入探索胃癌发生进展过程中的关键分子及其分子机制,对胃癌的防治及患者预后的评估具有积极意义。SIN3A是一种具有6个高度保守结构域的具有分子支架功能的蛋白质,能够为各种转录因子提供作用的平台,从而对细胞功能进行不同程度的调节,还能够参与维持细胞稳态。SIN3A的异常调节能够参与多种恶性肿瘤的发生发展过程,其在乳腺癌、结直肠癌等组织中高表达,能够促进乳腺癌、结直肠癌等肿瘤细胞的增殖、侵袭等能力,发挥促癌作用,而在非小细胞肺癌组织中呈低表达,能够抑制肺癌细胞增殖并促进其凋亡,发挥抑癌作用。SIN3A在胃癌中的作用及相关分子机制目前尚不清楚,有待于进一步研究。研究目的:探讨SIN3A在胃癌中的表达情况及其与临床病理参数和预后的相关性,明确SIN3A对胃癌细胞生物学行为的影响,深入探讨SIN3A在胃癌发生进展过程中的作用及分子机制。研究方法:第一部分:SIN3A在胃癌中的表达及对胃癌细胞生物学行为的影响。1.TCGA公共数据库下载胃癌（STAD）level 3 HTSeq-FRKM格式的RNAseq数据,进行TPM格式转换和log2转化,用R 3.4.3软件做差异分析,明确SIN3A在胃癌中的表达情况,以及其与临床病理参数的关系。结合Kaplan-Meier生存分析明确SIN3A表达与胃癌患者预后的关系,运用COX单因素回归分析和多因素回归分析证实SIN3A是否为影响胃癌患者预后的独立危险因素。2.应用免疫组化检测77对胃癌及癌旁正常组织中SIN3A的表达情况,分析其与临床病理参数及胃癌患者预后的关系。运用q PCR检测SIN3A在5株胃癌细胞系及胃永生化上皮细胞GES-1中的表达。3.利用基因转染技术,构建SIN3A干扰及过表达细胞模型,通过CCK-8、细胞克隆实验检测SIN3A对胃癌细胞增殖能力的影响,通过细胞划痕、Transwell侵袭实验分别检测SIN3A对胃癌细胞迁移及侵袭能力的调控作用,应用流式细胞仪分别检测SIN3A对胃癌细胞凋亡及周期的影响。第二部分:miR-1224-5p靶向调控SIN3A影响胃癌侵袭转移。1.通过在线生信预测软件Tarbase及Target Scan预测出SIN3A的上游miRNA,并预测互补序列。通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-1224-5p是否能与SIN3A 3’-UTR靶向结合,抑制其荧光素酶活性。构建miR-1224-5p干扰及过表达细胞模型,利用Western Blot验证miR-1224-5p表达变化对SIN3A蛋白表达的影响。2.利用q PCR检测67对胃癌及癌旁正常组织中miR-1224-5p的表达情况,结合病例资料,进一步分析miR-1224-5p表达与临床病理参数的关系,并利用受试者工作特征曲线（ROC）分析miR-1224-5p对胃癌诊断的敏感度及特异度。运用q PCR检测miR-1224-5p在5株胃癌细胞系及胃永生化上皮细胞GES-1中的表达。3.通过CCK-8检测miR-1224-5p对胃癌细胞增殖的影响,利用细胞划痕实验及Transwell侵袭实验分别检测miR-1224-5p对胃癌细胞迁移及侵袭能力的影响,通过裸鼠皮下成瘤实验明确miR-1224-5p对胃癌生长的影响。4.通过CCK-8、细胞划痕实验以及Transwell侵袭实验在胃癌细胞中进行miR-1224-5p/SIN3A的功能回复,证实miR-1224-5p通过调控靶基因SIN3A的表达促进胃癌侵袭转移。第三部分:miR-1224-5p通过靶基因SIN3A调控胃癌侵袭转移的分子机制研究。1.分别利用Western Blot、q PCR、免疫荧光实验检测miR-1224-5p/SIN3A表达变化对EMT相关指标的影响。通过Western Blot及免疫荧光明确SIN3A、miRNA-1224-5p变化对H3K27ac的影响,通过在线生信分析软件Chip Base预测H3K27ac与E-cadherin（CDH1）结合位点,并通过CHIP-seq实验进一步验证。2.收集AGS细胞总蛋白,利用Thermo Fisher Scientific 1200液相系统和Q Exactive质谱仪对样品进行分析鉴定。利用co-IP法检测AGS细胞中SIN3A特异性结合蛋白,对获得的特异性蛋白进行富集分析、KEGG信号通路分析等生信分析,找到与EMT相关的蛋白,阐明对胃癌EMT调控可能的分子机制。研究结果:第一部分:SIN3A在胃癌中的表达及对胃癌细胞生物学行为的影响。1.利用TCGA数据库下载胃癌数据集,其中:胃癌375例,癌旁正常组织32例,结果表明:与癌旁正常组织相比,SIN3A m RNA在胃癌组织中表达显著增高,差异具有统计学意义（p＜0.001）。SIN3A的表达在年龄、性别、肿瘤远处转移、组织学分级及幽门螺杆菌感染中均无明显差异,但与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关,通过单因素logisitic回归模型分析,淋巴结转移、TNM分期、残胃癌和年龄是胃癌发生的危险因素。利用Kaplan-Meier生存分析绘制生存曲线,结果表明,胃癌患者生存率在SIN3A高表达组低于低表达组,但SIN3A并不是影响患者临床预后的独立危险。2.在77对人体组织标本中,SIN3A在胃癌组织中呈高表达,SIN3A的高表达与肿瘤组织大小、肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期相关,差异均具有统计学意义（p＜0.05）。SIN3A与胃癌患者预后有关（p=0.021）,但不是影响胃癌预后的独立危险因素。3.细胞功能学实验结果表明,HGC27细胞中,过表达SIN3A能够促进胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,抑制细胞凋亡;AGS细胞中,干扰SIN3A的表达能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,促进细胞凋亡。SIN3A表达变化对细胞周期调控无影响,差异无统计学意义（p＜0.05）。第二部分:miR-1224-5p通过调控靶基因SIN3A的表达促进胃癌侵袭转移。1.通过Tarbase、Target Scan在线生信预测网站,预测出SIN3A可能是miR-1224-5p的靶基因之一,并利用双荧光素酶报告实验证实miR-1224-5p能够与SIN3A 3’-UTR靶向结合。通过Western Blot进一步验证miR-1224-5p对SIN3A的靶向调控关系:干扰miR-1224-5p表达后,SIN3A蛋白表达上调;过表达miR-1224-5p后,SIN3A蛋白表达有所下调;差异均具有统计学意义（p＜0.05）。2.在67对胃癌（GC）及癌旁组织（ANT）中,GC表达量明显低于ANT,差异具有显著统计学意义（p＜0.0001）。通过进行ROC曲线绘制,miR-1224-5p诊断胃癌的敏感度77.6%,特异度67.2%。miR-1224-5p在胃癌组织中的低表达与肿瘤部位（胃窦）（p=0.020）、肿瘤浸润深度（p=0.047）、有无淋巴结转移（p=0.046）、TNM分期（p=0.019）相关。3.细胞功能学实验结果表明,干扰miR-1224-5p表达能够促进HGC27细胞的增殖、迁移及侵袭能力;相反,过表达miR-1224-5p能够抑制在AGS细胞的增殖、迁移及侵袭能力。裸鼠成瘤实验结果显示注射稳转LV-miR-1224-5p细胞组的瘤体生长速度慢于对照组,收取的瘤体组织重量明显低于对照组,差异均具有统计学意义。4.CCK8、细胞划痕及Transwell侵袭实验结果表明:共转染LV-SIN3A和miR-1224-5p mimics后,HGC27细胞增殖能力较转染LV-SIN3A明显减弱（p=0.034）,24h、48h伤口愈合率明显下降（24h p=0.0179,48h p=0.0007）;共转染LV-SIN3A-RNAi和miR-1224-5p inhibitor后,AGS细胞增殖能力较转染LV-SIN3A-RNAi明显增强（p=0.0064）,24h、48h伤口愈合率明显增强（24h p=0.0084,48h p=0.0001）,共转染LV-SIN3A和miR-1224-5p mimics后穿过Transwell小室膜的细胞数量显著减少（173.2±1.176 vs 45.22±1.128,p＜0.0001）。第三部分:miR-1224-5p调控靶基因SIN3A促进胃癌侵袭转移的机制研究。1.q PCR结果提示:AGS细胞过表达miR-1224-5p后,E-cadherin表达上调,Vimentin和Slug表达下调,差异具有统计学意义（p＜0.01）。免疫荧光染色实验分别观察转染miR-1224-5p mimics组、共转染miR-1224-5p mimics及LV-SIN3A组的HGC27细胞EMT相关指标的荧光强度及面积变化。实验结果显示,共转染组Vimentin表达较过表达miR-1224-5p组增加,相反,E-cadherin表达下降。共转染miR-1224-5p inhibitor及LV-SIN3A-RNAi,同步设立对照组,应用Western blot检测各组EMT相关指标变化,共转染组能够逆转SIN3A表达下调所导致的EMT促进作用。2.在AGS细胞中分别下调SIN3A和上调miR-1224-5p的表达,H3K27ac的荧光强度及蛋白表达量较对照组均有增加。通过Chip Base在线分析软件预测出E-Cadherin的启动子区有两个H3K27ac结合位点,利用CHIP-seq实验进一步证实:AGS细胞中下调SIN3A表达后,E-Cadherin启动子区有H3K27ac富集峰。3.利用co-IP法筛选AGS细胞中SIN3A特异性结合蛋白131个,其中,CTNND1蛋白主要发挥结合和稳定钙粘蛋白的作用而参与调节多种肿瘤的发生发展过程,经pearson相关分析发现:CTNND1与E-cadherin表达呈正相关（r=0.605）,差异具有统计学意义（p＜0.001）,干扰SIN3A表达后CTNND1表达上调,并且E-cadherin的表达与CTNND1同步升高,Vimentin、Slug表达下调,差异均具有统计学意义（p＜0.01）。研究结论:1.SIN3A在胃癌组织中呈高表达,其表达水平与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关。SIN3A与胃癌预后相关,但不是胃癌预后的独立危险因素。SIN3A能够促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,抑制凋亡。2.SIN3A是miR-1224-5p的靶基因之一,miR-1224-5p在胃癌组织中呈低表达,对胃癌有一定的诊断效能,其低表达与肿瘤部位、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期相关。miR-1224-5p能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移与侵袭。miR-1224-5p通过靶向调控SIN3A抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。3.miR-1224-5p通过靶基因SIN3A调控胃癌细胞EMT。干扰SIN3A能够增加E-cadherin启动子区H3K27乙酰化活性,从而抑制胃癌细胞EMT。SIN3A可能通过与其特异性蛋白CTNND1结合,协同调控胃癌细胞EMT。