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糖尿病(diabetes mellitus,DM)和帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是两种世界性常见和高发的慢性疾病,严重威胁着人类的健康和生命。最近连续发表在糖尿病研究领域权威杂志《Diabetes Care》的3篇流行病学的调查结果显示:随着2型糖尿病的发病率的持续上升,患者患PD的几率也呈现上升的趋势,且2型糖尿病患者比正常人患PD的几率要高83%以上。近年来,有关糖尿病与中枢系统疾病,尤其是与PD之间的关系逐渐受到重视。在糖尿病患者中发现,病人的轴性体征、强直以及震颤均有不同程度的加重,提示着糖尿病与PD发生的相关性,糖尿病可能是诱导PD发生的一种危险因素。2010年,Morris等人研究发现2型糖尿病大鼠模型中黑质致密部(DSN)出现铁沉积,多巴胺(dopamine,DA)能神经元受损,及纹状体多巴胺分泌减少,推测有可能是因为高糖作用下,黑质致密部(DSN)铁沉积导致的氧化应激的增加,而多巴胺能神经元是对氧化应激敏感的神经元,更容易受到铁沉积毒素的作用,从而使2型糖尿病大鼠出现PD病理特征。尽管如此,有关糖尿病并发PD的具体机制还不清晰。我们课题组在PD病人脑中首次发现1-乙酰-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(1-acetyl-6,7-dihyroxy-1,2,3,4-Tetrahydro-isoquinoline,ADTIQ),其结构与1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)类似。由于ADTIQ是多巴胺与丙酮醛通过Pictet-Spengler(P-S)反应生成的产物,丙酮醛与葡萄糖代谢密切相关,因此我们推测ADTIQ有可能在糖尿病并发PD的过程中发挥关键作用。本课题围绕ADTIQ展开了物质合成,方法建立,含量检测,毒性实验等研究,探索糖尿病并发PD的致病机制。主要研究内容和研究结果如下:1.由于ADTIQ没有商业化的纯品,因此本课题首先完成了ADTIQ的化学合成与鉴定:采用Pictet-Spengler法,由多巴胺和丙酮醛一步合成ADTIQ,通过半制备高效液相色谱法制备出纯品,并利用红外、质谱、核磁等方法进行结构鉴定。结果表明:以多巴胺和丙酮醛(1:10)为底物,氮气保护在三氟乙酸的缓冲液中,37℃反应24小时后。半制备HPLC收集ADTIQ纯品,冷冻干燥后得到纯度大约82%的ADTIQ。结构鉴定结果表明我们成功得到ADTIQ。2.由于ADTIQ在生物体内的含量低,不易检测,因此本课题建立了ADTIQ的HPLC-MS/MS(multi-reaction monitoring,MRM))的高灵敏度检测方法,为ADTIQ的有效和准确检测提供了技术保障。3.本课题以SH-SY5Y细胞为模型,探索ADTIQ在细胞中的形成条件。结果显示:外源性丙酮醛与神经元内储存的神经递质多巴胺不易发生反应生成ADTIQ;葡萄糖代谢异常增加导致内源性丙酮醛含量的增加,并与神经元内的多巴胺反应是ADTIQ生成的前提。4.本课题对高糖诱导的SH-SY5Y细胞模型和2型糖尿病Sprague-Dawley大鼠模型进行研究,探索高糖与ADTIQ生成的关系。结果显示:体外和体内模型中,高糖引起的多巴胺神经元功能受损,导致多巴胺分泌减少;同时,我们检测到SH-SY5Y细胞内以及糖尿病SD大鼠纹状体ADTIQ和前体丙酮醛含量升高。说明ADTIQ以及前体丙酮醛的形成与神经元的损伤相关。5.本课题以SH-SY5Y细胞为多巴胺能神经元模型,研究ADTIQ对多巴胺能神经元的损伤机制,并通过对α-Synuclein WT,α-Synuclein A30P和α-Synuclein A53T,研究转基因PD小鼠模型中ADTIQ含量的检测,探索α-synuclein过表达的PD模型中ADTIQ与PD的相关性。结果显示:在ADTIQ的刺激条件下,多巴胺能神经元中促凋亡蛋白Bax激活,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,导致细胞色素C的释放,引起casepase-3切割的增加,最终引发线粒体损伤,促进细胞凋亡。此外,过表达突变型的α-Synuclein的PD小鼠中ADTIQ的含量较正常组和过表达野生型α-Synuclein组显著增加(p<0.05),提示ADTIQ可能在突变型的α-synuclein聚集导致的PD发病过程中发挥了重要作用。SSAO(semicarbazied-sensitive amine oxidases)是一类对氨基脲敏感的胺氧化酶,SSAO导致的管病变在糖尿病的发病中起着至关重要的作用。本课题成功地建立了人类脐动脉内皮细胞(human umbilical arterial endothelial cell,HUAEC)过表达SSAO的细胞模型,并与原核E.coli BL21模型,细胞系HEK模型以及人脐动脉动脉组织中表达的SSAO进行表达量,表达活性以及表达形式的比较,为今后SSAO在糖尿病以及PD的病因学研究提供一个基础的工具细胞模型。本研究发现ADTIQ的形成与糖尿病及PD之间的联系具有相关性,为以后研究糖尿病并发PD的机制提供一条新的思路。