论文部分内容阅读
目的:研究二肽重复蛋白Poly-GR和Poly-PR对细胞自噬通路的影响,并探索其影响的作用机制。方法:体外培养 HEK 293,HEK 293T,ATG5-KO MEF 以及 ATG5-WT MEF 等细胞系作为工具;用RNAiMax做为转染试剂,转染目的基因的siRNA,构建Beclin1基因缺陷的细胞模型;用Lipofectamine 2000转染质粒,在细胞中过表达相应的目的蛋白,构建细胞模型;用Earle’s Balanced Salt Solution(EBSS)处理细胞,构造细胞饥饿模型;用Western blot方法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、GFP融合蛋白、GAPDH、mTORC1下游的靶基因p70S6K及其磷酸化水平、Beclin1、Bcl-2及其S87和S70位点的磷酸化水平;用DAPI染细胞核;免疫荧光实验检测细胞中的目的蛋白;利用激光共聚焦显微镜或荧光显微镜观测细胞中相关蛋白的表达、聚集、定位及共定位情况;用ImageJ分析细胞的荧光强度。成果:(1)二肽重复蛋白中含精氨酸的Poly-GR和Poly-PR能够显著降低细胞中LC3-Ⅱ的水平,抑制自噬小体的生成;不同剂量的Poly-GR和Poly-PR呈现不同程度的抑制自噬小体生成。(2)通过双标的LC3检测自噬小体和自噬溶酶体的数量可知,含精氨酸的Poly-GR蛋白能够明显抑制自噬小体的生成,但对自噬小体和溶酶体融合成自噬溶酶体的过程没有影响;在饥饿的情况下,Poly-GR和Poly-PR蛋白能够显著抑制细胞对于Htt-60Q和Htt-150Q的自噬降解;该抑制作用在ATG5-WT MEF中也有相似的结果,但在ATG5-KOMEF中没有抑制作用,进一步证明该抑制影响的是细胞自噬通路。(3)Poly-GR和Poly-PR蛋白能够改变mTOR的溶酶体定位,抑制mTOR的活性,促进TFEB的细胞核移位。(4)在饥饿的情况下,Poly-PR蛋白影响了自噬起始蛋白ATG5、ATG9、ATG16和DFCP1的细胞定位。(5)Poly-PR蛋白促进了细胞中Beclin1和Bcl-2的结合,从而抑制了自噬的起始。(6)Poly-PR蛋白降低了 Bcl-2的S87、S70位点的磷酸化水平,促进了 Bcl-2与Beclin1的结合,并且细胞敲减Beclin1后,自噬小体生成明显减少,不受Poly-PR蛋白影响。(7)细胞中利用GFP-LC3-RFP-LC3 AG检测自噬流。分析荧光强度可知,在饥饿情况下,Poly-GR蛋白能够显著降低细胞自噬强度。结论:含精氨酸的二肽重复蛋白Poly-GR和Poly-PR能够降低Bcl-2的磷酸化水平,促进Beclin1和Bcl-2的结合,影响自噬起始蛋白ATG5、ATG9、ATG16和DFCP1,从而降低细胞内的自噬小体生成。